不同磷濃度下氮磷比對小球藻生長的影響

孔欣　張樹林　戴偉　張達娟　畢相東

摘要：通過室內試驗研究不同磷濃度條件下氮磷比對小球藻（Chlorella vulgaris）生長的影響。結果表明，在低磷濃度（0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L）和中磷濃度（0.4mg/L、0.6mg/L）下，隨著氮磷比值增大，小球藻密度逐漸升高。在高磷濃度（0.8mg/L、1mg/L）下，小球藻密度隨著氮磷比增大呈先升高后下降趨勢。磷濃度為0.8mg/L條件下，N∶P=40∶1時，小球藻細胞密度達到最大值;磷濃度為1mg/L條件下，N∶P=30∶1時，小球藻細胞密度達到最大值。以上研究結果表明，小球藻生長既受氮磷營養鹽濃度水平影響又受氮磷比值影響。

關鍵詞：小球藻;磷;氮磷比;生長

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200215003

收稿日期：2019-12-20

基金項目：天津市自然科學基金重點項目（項目編號：18JCZDJC97800）;天津市自然科學基金項目（項目編號：19JCYBJC30000）;天津現代產業技術體系-水產-水質調控崗位（項目編號：ITTFR2017015）;天津市高等學校創新團隊“天津現代水產生態健康養殖創新團隊” （項目編號：TD13-5089）

作者簡介：孔欣（1995-），女，碩士，研究方向：養殖水質調控;通訊作者張樹林（1963-），男，教授，研究方向：養殖水質調控。

營養鹽是水體中浮游生物賴以生存的主要營養來源，其組成和含量直接影響生物的代謝活動及藻類的生長情況[1]。其中，氮、磷營養鹽被認為是藻類生長過程中最關鍵的2個限制因素。氮磷會直接影響藻類吸收和同化的效率，進而影響藻類的生長和胞內物質的積累[2]。另外，氮和磷的作用需要相互配合，不同藻類對氮磷的需求量也不同。一般在低氮磷濃度下，藻類生長緩慢，隨著濃度增加，生長速率逐漸增高[3]。李小梅等得出微藻在氮磷比等于16時生物量最大，在氮磷限制情況下生長速率明顯降低，并影響藻細胞的最大光能轉化速率和實際光能轉化效率[4]。

小球藻是水體微藻中的重要資源，有生長速度快、環境耐受力強等特點[5]。此外，其還可以吸收水體中大量的氮磷作為自身生長的營養物質，既抑制了有害藻類，凈化水體環境，又為其他水生生物提供了餌料[6]。Wu等指出無論氮濃度或高或低，小球藻都可以適應生長，但缺少磷源的情況下卻難以存活，磷是小球藻的限制因子[7]。因此，本文通過配制不同磷濃度下不同氮磷比的培養液培養小球藻，通過細胞密度變化及生長速率變化探究不同磷濃度下氮磷比對小球藻生長的影響，以期為小球藻大規模培養提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養基

試驗用小球藻藻株購自中國科學院水生生物研究所，培養基為BG11培養基。

1.2 試驗設置

[JP2]將處于對數生長期的小球藻藻液離心（5000r/min，5min）后獲得的沉淀用無菌水重復洗滌3次，然后加入到未添加尿素和 K2HPO4的簡易培養基中，初始藻液密度為2×106個/mL，再加入不同濃度的尿素和 K2HPO4，用尿素和 K2HPO4調節所需氮磷比。設置磷濃度為低濃度（0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L）、中濃度（0.4mg/L、0.6mg/L）和高濃度（0.8mg/L、1mg/L），氮磷質量比分別為 2∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、30∶1、40∶1、60∶1。每個試驗組設置3個平行。試驗為期10d，培養溫度為25℃，光照強度為2000lux，光暗比12h∶12h，每隔24h取藻液測定其在波長680nm下的吸光度。

1.3 測定方法

1.3.1 藻細胞密度標準曲線的建立

分別測定不同濃度梯度下小球藻藻液在波長680nm的吸光度，并用顯微鏡計數相應吸光度下小球藻的細胞密度，擬合藻細胞密度標準曲線。

1.3.2 藻細胞密度測定

利用紫外分光光度計在波長680nm下測定小球藻吸光度值，經過藻細胞密度標準曲線得到小球藻藻細胞密度。

1.3.3 比增長率的計算

參考易文利文獻[8]計算小球藻比增長率，計算公式如下：

式中，Nt為第 t 天時的藻細胞密度;N0為某一時間間隔開始時的藻細胞密度;Δt為某一時間間隔。

1.4 統計分析

試驗結果采用平均值±標準差（Means±SD）表示，用SPSS18.0中one-way ANOVA進行方差分析，LSDS多重比較檢驗各試驗組間是否具有顯著差異（P <0.05）。

2 結果與分析

2.1 小球藻藻細胞密度標準曲線

本試驗測得的小球藻藻細胞密度和吸光度之間的關系如圖1所示。試驗過程中測得藻液在波長680nm下的吸光度，即可根據標準曲線換算出藻細胞密度。

2.2 不同磷濃度下氮磷比對小球藻生長的影響

如圖2所示，低磷濃度（0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L）下，隨著氮磷比值增大，小球藻密度逐漸升高。在培養時間內低氮磷比試驗組與高氮磷比試驗組差異顯著（P<0.05）。中磷濃度（0.4mg/L、0.6mg/L）下，隨著氮磷比值增大，小球藻密度呈升高趨勢。在前2d內，不同氮磷比試驗組小球藻細胞密度均無顯著差異（P>0.05）。從第3天開始，氮磷比為2∶1試驗組小球藻細胞密度顯著低于其他試驗組。培養至第5天后，氮磷比為60∶1試驗組小球藻細胞密度開始顯著高于其余各試驗組細胞密度（P<0.05）。

在高磷濃度（0.8mg/L、1mg/L）下，小球藻密度隨著氮磷比增大呈先升高后下降趨勢。磷濃度為0.8mg/L條件下，N∶P=40∶1時小球藻細胞密度達到最大值（3.1×107個/mL），隨著氮磷比值繼續增大，小球藻密度顯著下降;磷濃度為1mg/L條件下，N∶P=30∶1時小球藻細胞密度達到最大值（3.4×107個/mL），隨著氮磷比值繼續增大，小球藻密度呈下降趨勢。磷含量為0.8mg/L時，高氮磷比組小球藻細胞密度顯著高于低氮磷比組（P<0.05）。

2.3 不同磷濃度下氮磷比對小球藻比增長率的影響

如圖3所示，每種磷濃度下，不同氮磷比試驗組間小球藻比生長率均存在顯著差異（P<0.05）。低磷與中磷濃度下隨著氮磷比值升高，小球藻比生長率呈升高趨勢，均在氮磷比為60∶1時達到最大值。但在高磷濃度（0.8mg/L、1mg/L）下，隨著氮磷比值升高，小球藻比增長率呈先升高后下降趨勢。在P=0.8mg/L，N∶P=40∶1時，小球藻比增長率最高;P=1mg/L，N∶P=30∶1時，小球藻比增長率最高。

3 討論

在浮游植物生長過程中，營養鹽的輸入起關鍵性作用[9]。一般來說，氮和磷是影響藻類生長最重要的限制性因素，并且氮和磷的作用也是相互的[10]。本試驗顯示，在磷濃度低于0.6mg/L時，隨著氮磷比值增大，小球藻密度逐漸升高。孟順龍研究得出，小球藻藻細胞隨著氮磷的增加而增加，豐富的氮磷濃度可使小球藻快速生長，在一定范圍內，高氮磷組最適合生長，與本試驗結果相一致[11]。在高氮磷比水體中，浮游藻類會利用水體中的氮磷元素進行大量繁殖，使水層的透光率大大降低，抑制其他有害藻類的正常生長，對緩解水體富營養化起著積極作用[12]。但藻類生長時營養物質缺乏對其生長量和脂肪產量也有顯著影響[13]。當氮元素不足時會影響藻類細胞內的氨基酸合成;磷元素不足時影響藻類的光合轉化效率，削弱藻細胞的光合作用，使其生長停滯不前[14]。許可等研究表明當磷濃度小于0.4mg/L時，氮磷比越低，小球藻的生長和光合作用越會受到抑制[15]。

在本研究選取的高磷濃度范圍內，低氮磷比下小球藻生長速率最低，并且隨著氮磷比升高，小球藻生長速度呈先上升后下降趨勢。低氮磷比時由于培養基中磷充足，使得小球藻過量吸收，細胞內儲存更多的磷，為快速生長提供了物質條件[16]。但并不是氮磷比越高小球藻生長就越好，過高的氮磷比反而會抑制小球藻的生長。劉聰得出氮磷營養物過高或過低都會顯著影響小球藻的生長和色素的積累[17]。因此在培養小球藻時，選擇合適的氮磷比才可以促進小球藻的快速生長。

磷是合成DNA和RNA的重要物質，也是影響小球藻生長的主要因素。當磷濃度過低時，導致藻細胞分裂速度減慢，吸收氮磷營養鹽受限制，使其不能快速生長[18]。本試驗中，在氮磷比相同的情況下，磷濃度越高，小球藻密度越大。馬彩虹等研究得出在高磷濃度下小球藻的生物量和比增長速率高于低磷濃度水平[19]。低磷濃度下小球藻受到的抑制作用相對較大，削減其光合效率，被吸收的光能直接轉化成熱和熒光發射[20]。

4 結論

低磷水平和中磷水平下氮磷比值為2∶1～60∶1范圍內，低氮磷比不利于小球藻生長，高氮磷比有利于小球藻生長;高磷水平下，小球藻生長在一定的氮磷比值范圍內隨氮磷比升高而加快，但過高的氮磷比反而會抑制小球藻的生長。因此，在高密度培養小球藻時，氮磷營養鹽是一個重要影響因素，適宜的氮磷濃度及氮磷比可以使小球藻快速增殖。

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（責任編輯 賈燦）