樣品保存液在豬口腔液檢測中的應用

柴偉東

（勃林格殷格翰動物保健（上海）有限公司，上海 200040）

近些年來，國內外動物醫學界對豬口腔液的研究報道日漸增多和深化，特別是國內非洲豬瘟發生以來，多個研究證實口腔液中的病毒檢出時間點比血液中早1～4 d[1]，表面口腔液可作為血清樣品的替代品，早期監測和評估豬群整體健康狀況的診斷樣品。豬口腔液由唾液和血清滲出液組成，除水分之外還有具有生物效能的黏液素、淀粉酶、溶菌酶、脂肪酶等成分，同時豬口腔液中有大量的細菌及外界的糞便、飼料等復雜成分。

目前普遍認可的口腔液保存方法是將樣品置于生理鹽水中，儲運在有藍冰（冰袋）的條件下，溫度可維持在0～8 ℃，最好在24 h內檢測。在實踐中，大量樣品的采集持續時間較久，樣品并沒有一直維持在冷藏環境中，有時候運輸距離也較遠，時間超過了24 h，用常規的生理鹽水方法保存和運輸樣品，使得口腔液樣品中的核酸酶及細菌大量增殖產生的蛋白成分可能會導致其中的病毒核酸容易降解，進而影響核酸提取質量及檢測結果。針對病毒特性和不同類型的樣品特點，應確定相應的儲運溫度和樣品保護液的使用。

表1 引物和探針序列

1 材料和方法

1.1 豬口腔液樣品的采集

在早晨飼喂前，豬只最活躍的狀態下采集口腔液。取直徑1.6 cm，長度1 m的棉繩，將兩端松散，兩端下垂懸掛在飼喂欄上，繩子盡量離開地面和污染的欄柱，繩子末端與豬肩胛部高度相同，保證豬容易接觸到，讓豬自由咀嚼30 min，將棉繩濕潤的末端放入密封袋，用力擠壓，將擠出來的口腔液轉移到離心管中。樣品運輸到實驗室后對樣品不進行離心處理，直接冷凍保存。

1.2 實驗環境

所有實驗步驟均在生物安全二級（BSL-2）實驗室內完成，其中病毒參考品的制備，樣品分組以及樣品核酸提取均在生物安全柜內操作。

1.3 參考品的制備

對上述口腔液應用核酸檢測方法排除了PRRS和PR病原。將口腔液分為2組，每 ml加入100 μL病毒原液，制成2種病毒的參考品，使參考品初始病毒核酸量在105～106copies/μL范圍之間。

1.4 樣品分組及保存

將參考品按1∶10的比例加入生理鹽水中，渦旋混勻后，按每管210 μL分裝制成生理鹽水組樣品，分別置于4 ℃冰箱（2～8 ℃）、室溫（22～25 ℃）和高溫（40 ℃）條件下保存1 d、3 d和7 d。商業化的樣品保存液A、B和C組樣品以同樣的方式處理。分別于各個時間點取兩個平行樣品置于-80 ℃保存。

1.5 樣品核酸提取

取各個時間點樣品200 μL，用賽默飛公司的MagMAX? CORE Nucleic Acid Purification Kit核酸提取試劑盒進行樣品核酸提取。

1.6 探針法實時熒光定量PCR方法檢測

PRRSV的qRT-PCR方法使用Takara公司的一步法試劑（One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit），PRV的qRT-PCR方法使用北京擎科公司的試劑（2XT5 Fast qPCR Mix (Probe)）。引物和探針序列見表1。用天隆Gentier 32R實時PCR系統對各樣品進行熒光PCR分析。以1×100～1×106copies/μL的稀釋質粒樣品制作標準曲線，計算各樣品的病毒檢出量。

2 結果

2.1 參考品初始病毒核酸量及其CT值

本實驗以參考品0 d時檢測的病毒檢出量為基值，計算并比較各時間點樣品病毒檢出量的變化。其中PRRSV參考品0 d時CT值為21.24，病毒核酸量為1×105copies/μL；PRV參考品0 d時CT值為22.91，病毒核酸量為1×105copies/μL。

2.2 樣品保存液對口腔液樣品中核酸檢出量的影響

在第3天冷藏環境中，生理鹽水組在第3天時PRRS病毒檢出量低于50%，PR病毒檢出量下降18%，低于樣品保存液組；3種不同的商業保存液A、B、C都對病毒核酸有較好的保護作用，沒有差異。在第3天常溫和高溫環境中，生理鹽水組PRRS病毒檢出量低于70%～80%，PR病毒檢出量下降30%～40%，低于樣品保存液組；3種不同的商業保存液A、B、C都對病毒核酸有較好的保護作用，沒有顯著差異。

在第7天冷藏環境中，生理鹽水組在第7天的時候PRRS病毒檢出量低于90%，PR病毒檢出量下降36%，低于樣品保存液組；3種不同的商業保存液A、B、C都對病毒核酸有較好的保護作用，沒有顯著差異。在第7天常溫和高溫環境中，生理鹽水檢測不出PRRSV，PR病毒檢出量下降到80%以下，顯著低于樣品保存液組；3種不同的商業保存液A、B、C都對病毒核酸有的保護作用，雖然沒有顯著差異，但以樣品保存液A的保護核酸效果較為優秀。如圖1所示。

3 討論

豬口腔液在疾病診斷、檢測和健康狀態分析等方面已得到了良好的推廣應用，但口腔液樣品的儲運一直是其應用的限制因素之一。口腔液樣品成分復雜，含有大量的酶類（包括核酸酶），而這些樣品中的病毒等檢測的靶標為病毒的核酸，極易受到樣品中核酸酶的影響而降解。此外，口腔液中大量的細菌增殖所產生的毒素與大蛋白分子對病毒核酸和樣品處理也帶來了極大的干擾。用常規生理鹽水，即使儲運于冷藏環境，也無法做到很好的保護樣品中病毒核酸的作用。因此，需要盡早抑制樣品中RNA酶活性及病原的增殖。

目前市面上商業化的樣品保存液有多種，成分包括表面活性劑、異丙醇、無水乙醇、銨鹽等單品或多種復合成分，作用主要為殺死樣品中的病原微生物和保護釋放出來的核酸。通過比較3種商用樣品保存液與生理鹽水的區別，發現現有的保存液A、B和C在不同溫度和時間條件下都有保護PRRSV和PRV的作用，彼此之間沒有顯著差異，但對RNA病毒的保護作用在第7天明顯下降；而常規使用的生理鹽水在各種條件下均不能保護口腔液樣品中的核酸，在第7天的時候已檢測不到PRRSV。

此外，溫度在樣品儲運中也起到至關重要的作用。實驗中4 ℃保存條件的2種病毒參考品的核酸量降低幅度都小于室溫和高溫條件，說明低溫運輸有利于獲得正確樣品核酸檢測值。干冰的溫度為-74 ℃，對病毒核酸樣品的保護更有利，但干冰運輸的成本較高。使用藍冰冷藏運輸并結合使用任何一種樣品保存液作為保護劑，在7 d的時候PRRSV的檢出量仍高于30%，PRV的檢出量高于80%。而7 d的時間足夠將口腔液樣品從國內北方運輸到南方，并完成檢測，其檢測結果較為可靠。因此，以樣品保存液為樣品保護劑和藍冰冷藏運輸配套即可基本滿足口腔液樣品中病毒核酸檢測的需求。

為了更好地測試保存和運輸條件對于口腔液中病毒核酸樣品的影響，實驗所使用的模擬樣品的起始濃度為1×105～1×106copies/μL，檢測的CT值為20～23，此樣品濃度在實時熒光定量PCR檢測方法的最佳檢測范圍內[4]。但實驗的模擬樣品與實際口腔液樣品相比其病毒核酸濃度偏高，其目的在于展示儲運條件對于核酸樣品檢測的影響。實際口腔液樣品攜帶其他病毒的樣品對儲運條件的敏感性也可以進行類似的實驗。