三種淡水魚類在中國南北兩個地區的腸道菌群差異比較

徐佳瑩，李 演，謝芝玲，陳漢娜，潘 登，劉 峰，陳 燕，梁淑淑，丁學知，夏立秋，張友明,，涂 強*

(1．淡水魚類發育生物學國家重點實驗室， 湖南師范大學生命科學學院， 微生物分子生物學湖南省重點實驗室， 長沙 410081； 2．亥姆霍茲抗感染國際實驗室， 山東大學亥姆霍茲生物技術研究所， 微生物技術國家重點實驗室，青島 266237； 3．青島科技大學， 化學與分子工程學院， 青島 266042；4．禹城保立康生物飼料有限公司， 德州 251200)

動物腸道中都包含著一個復雜的微生物生態系統，腸道中的微生物與宿主的各項生命活動息息相關，它們可能影響著宿主的生長代謝活動，營養消化功能，免疫功能以及抵御入侵病原體的能力等[1-3]。例如，微生物產生的活性產物短鏈脂肪酸可以抑制某些哺乳動物腸道中有害細菌的增殖來維持微生物群動力學，而且能夠增強腸道及遠處組織的免疫能力[4]。腸道環境與宿主的生長代謝密切相關，體內益生菌對維持腸道環境的穩定起著非常重要的作用，其產生的抗菌肽可直接抑制病原體生長，或為宿主提供像維生素一類的有益生長底物[5]。當宿主生長狀態或外界環境發生變化時，往往會引起動物的腸道微生物也發生改變，有研究表明，斑馬魚腸內的細菌群落隨著宿主由幼體到成熟不斷生長而變得越來越多樣化[6]。在進行草魚的腸道微生物研究中，喂養黑麥草能夠顯著增強腸道微生物群的碳水化合物、氨基酸和脂質的代謝作用[7]。

魚的生長水環境中高豐度的銅綠假單胞菌會引起魚的腸道杯狀細胞增殖和腸脫落，促進炎癥因子的轉錄，從而改變腸道菌群結構[11]。硫化物對水體的污染會引起凡納濱對蝦腸道組織損壞，炎癥和免疫相關因子發生一系列的變化，使得腸道中潛在病原菌數量增加，有益菌數量減少[12]。目前，腸道微生物在生物研究領域起著越來越重要的作用，16s rDNA擴增子測序技術作為研究微生物群落的重要手段，能夠鑒定出腸道中幾乎所有物種，并能基于測序數據進行后續的生物分析，從而快速地推動動物腸道微生物的研究和發展。

湖南省屬于我國華中地區，界于北緯24°38′～30°08′，東經108°47′～114°15′之間，多山地和湖泊，四季分明，淡水魚種類繁多；山東省屬于我國華東沿海地區，北緯34°22.9′～38°24.01′，東經114°47.5′～122°42.3′之間，氣候較湖南相比更加干燥，盛產海水魚類，兩地相距1 100 km。對于兩地的草魚，鯽魚和鯉魚三個品種的腸道微生物的比較分析迄今尚無報道。

本試驗選取湖南本土草魚、鯉魚和鯽魚各6尾，山東本土草魚、鯉魚和鯽魚各6尾，基于Ion S5TMXL測序平臺，對以上36個樣本的腸道微生物16s rRNA V4高變區進行擴增，分析腸道菌群結構，比較有益菌和有害菌的豐度差異，為淡水魚的健康養殖提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及處理

本試驗共采集36個生長狀況良好、魚齡為1齡的魚樣，其中禹城魚塘和望城魚塘的草魚[平均體重(600±50)g]各6尾，組別為山東草魚組(SC組)和湖南草魚組(HC組)；禹城魚塘和望城魚塘的鯽魚[平均體重(170±30)g]各6尾，組別為山東鯽魚組(SJ組)和湖南鯽魚組(HJ組)；禹城魚塘和望城魚塘的鯉魚[平均體重(550±50)g]各6尾，組別為山東鯉魚組(SL組)和湖南鯉魚組(HL組)。超凈工作臺內進行解剖，取其腸道內容物置于無菌的EP管內，迅速冷凍，放-80 ℃冷凍保存，以備后續試驗使用。

1.2 DNA提取和PCR擴增

使用Mobio公司PowerFecalTMDNA Isolation kit試劑盒提取36個樣本中的微生物基因組，擴增16s rRNA 的V4高變區，引物名稱為515F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和806R(GGACTACHVGGGTWTCT AAT)。基于Ion S5TMXL技術測序平臺，利用單端測序(Single-End)的方法，完成測序，測序數據用于后續統計分析。

1.3 數據分析

為了使測序數據更加準確和可靠，需將原始數據(raw data)經過質控和過濾處理，得到的即是有效數據(clean data)。基于有效數據以97%的一致性進行操作分類單位(operational taxonomic units,OTUs)聚類，并將OTUs的代表序列進行物種注釋，可獲得物種分布及豐度情況。基于OTUs進行統計分析，繪制物種稀疏曲線，體現各樣本的測序深度是否已達飽和。α多樣性分析是對單個樣本內部或組內進行分析，所得的數值可以體現樣本的物種豐富度和均勻度。LEfSe分析(LED effect size)可進行兩個或多個樣本的比較，找到樣本與樣本之間的差異物種，識別不同的豐度特征線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)值可代表差異物種對菌群結構的影響大小。對樣本中四種有益菌[鏈霉菌屬(Streptomyces)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，乳桿菌屬(Lactobacillus)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)]和五種有害菌[氣單胞菌屬(Aeromonas)，弧菌屬(Vibrio)，希瓦氏菌屬(Shewanella)，愛德華氏菌屬(Edwardsiella)和黃桿菌屬(Flavobacterium)]進行統計分析，探索腸道微生物群的穩定性和抗變化性，利于對魚類病害的研究與防治。對測序數據進行以上多種分析，將兩地區的樣本做對應的比較，可用于研究環境對淡水魚腸道微生物的影響。

2 結果與分析

2.1 樣本質量評估及物種多樣性分析

經過質控后，36個樣本共得到2 455 165個高質量的16s rRNA V4擴增子序列，以97%的一致性進行OTUs聚類，共得到4 934個OTUs，6個組所共有的OTUs有543個。根據稀疏曲線可見曲線逐漸趨于平緩，表明所得數據已經覆蓋樣本中絕大部分物種，測序數據趨于合理且可信度高(圖1a)。所有樣本的Good’s coverage指數均在99.0%以上，每個樣本都具有良好的抽樣完整性。shannon指數可以很好地反映樣本中物種豐富度和均勻度的大小，HJ和SJ，HC和SC，HL和SL進行Tukey檢驗結果顯示，相比較的組間豐富度和均勻度無顯著差異性(P>0.05)。在相似性分析(analysis ofsimilarities，ANOSIM)中，基于Bray-Curtis距離值的秩次進行組間差異顯著性檢驗，山東草魚組和湖南草魚組比較中組間差異明顯大于組內差異(R=0.307,P<0.05)，闡明不同的環境造成同一淡水魚品種的腸道微生物差異(圖1b)。鯽魚組和鯉魚組的ANOSIM分析結果中差異顯著性比較P>0.05，統計不具有顯著性。

圖1 樣本稀疏曲線和ANOSIM組間差異分析Fig.1 The rarefaction curves and analysis of ANOSIM differences (a)36個魚樣的樣本稀疏曲線；(b)HC組和SC組的ANOSIM組間差異分析(a)The rarefaction curves of 36 fish samples;(b)Analysis of ANOSIM differences between HC group and SC group

2.2 腸道微生物組成結構

在門水平上，物種相對豐度柱形圖中可發現，HJ組和SJ組的最優勢菌門為梭桿菌門(Fusobacteria)，且在兩個組中所占比例分別為(55.40±27.31)%和(38.44±19.72)%。在HJ組中，較優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)〔(19.24±17.05)%〕>硬壁菌門(Firmicutes)〔(15.80±5.07)%〕>擬桿菌門(Bacteroidetes)(7.58±5.01)%；而在SJ組中，較優勢菌門為硬壁菌門〔(31.50±26.24)%〕>變形菌門〔(13.78±10.29)%〕>擬桿菌門〔(8.14±0.94)%〕。HC組和SC組的最優勢菌門為擬桿菌門，在各組中占比分別為(35.88±15.55)%和(35.76±16.47)%。在HC組中，較優勢菌門為硬壁菌門〔(28.89±19.80)%〕>變形菌門〔(26.75±17.65)%〕>梭桿菌門〔(5.37±3.45)%〕；而在SC中梭桿菌門〔(22.28±18.05)%〕>硬壁菌門〔(13.28±5.10)%〕>螺旋體(Spirochaetes)(12.02±0.41)%。HL組和SL組的最優勢菌門為變形菌門，在各組中所占比分別為(34.31±18.24)%和(33.70±28.58)%，HL組中，較優勢菌門為硬壁菌門〔(22.96±22.83)%〕>梭桿菌門〔(16.40±14.37)%〕>擬桿菌門(11.60±2.91)%，而在SL組中梭桿菌門〔(30.77±7.53)%〕>擬桿菌門〔(14.89±8.65)%〕>硬壁菌門(9.55±4.30)%(圖2a)。如圖2a中所見，同一品種的魚樣中，環境不同，但腸道微生物中最優勢菌門為同一菌門，隨后較優勢菌門相對豐度大小順序有所變化。6個組中，變形菌門、梭桿菌門、硬壁菌門和擬桿菌門在各組中的所占比之和均在80%以上(圖2a)。在屬水平上，來自兩不同地區的鯽魚和鯉魚的腸道最優勢菌屬都是鯨桿菌屬(Cetobacterium)，草魚的最優勢菌都是擬桿菌屬(Bacteroides)(圖2b)。因此，相對于同一品種來講，地區差異并未造成最優勢菌屬的改變。

圖2 各組中腸道微生物門水平上和屬水平上的物種相對豐度Fig.2 Relative abundance of gut microbiome taxa on phylum category and genus category in each groups(a)HJ、SJ、HC、SC、HL和SL組的腸道微生物門水平上的物種相對豐度；(b)HJ、SJ、HC、SC、HL和SL組腸道微生物屬水平上的物種相對豐度(a)Relative abundance of gut microbiome taxa on phylum category in HJ, SJ, HC, SC, HL and SL groups;(b)Relative abundance of gut microbiome taxa on genus category in HJ, SJ, HC, SC, HL and SL groups

2.3 LEfSe分析

HJ組和SJ組的LEfSe分析結果顯示，氣單胞菌屬(Aeromonas)，氣單胞菌科(Aeromonadaceae)，氣單胞菌目(Aeromonadales)在HJ組中顯著富集(LDA>2.0,P<0.05)(圖3a)。且維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)和某些未鑒定的梭菌目(Clostridiales)在HJ組中的相對豐度遠高于SJ組，而在SJ組中未見顯著差異的差異物種(LDA>2.0,P<0.05)(圖3a)。在HC組和SC組的LefSe分析圖中，弧菌科(Vibrionaceae)，弧菌目(Vibrionales)和弧菌屬(Vibrio)在SC組中顯著密集，在SC組中硬桿菌(Firmicutesbacterium)和霍亂弧菌(Vibriocholerae)的相對豐度也高于HC組，梭菌綱(Clostridia)和梭菌目(Clostridiales)在HC組中顯著密集(LDA>2.0,P<0.05)(圖3b)。在HL組和SL組的LEfSe分析圖中，弧菌科，弧菌目和弧菌屬在SL組中顯著密集，而HL組中未見顯著差異的差異物種(LDA>2.0,P<0.05)(圖3c)。

圖3 LDA值分布柱狀圖Fig.3 Histogram of LDA value distribution(a)HJ和SJ組的LDA值分布柱狀圖；(b)HC和SC組的LDA值分布柱狀圖；(c)HL和SL組的LDA值分布柱狀圖(a)LDA value distribution histogram of HJ and SJ groups;(b)LDA value distribution histogram of HC and SC groups;(c)LDA value distribution histogram of HL and SL groups

2.4 4種有益菌和5種有害菌的分析比較

將4種有益菌和5種有害菌的相對豐度繪制成柱狀統計圖，4種有益菌的相對豐度柱狀圖中可見，3個品種的魚腸道中，4種有益菌的相對豐度所占比之和在兩地比較下差異不大(圖4a)；在5種有害菌的相對豐度柱狀圖中，相對豐度所占比之和在兩地比較下差異很大，其中HC組的氣單胞菌屬豐度遠高于SJ組，HL組的氣單胞菌屬相對豐度遠高于SJ組，而SC和SL的弧菌屬豐度遠高于對應的HC組和HL組(圖4b)。值得注意的是，愛德華氏菌屬不存在SJ組，SL組和SC組中，而在HJ組，HL組和HC組中都有較低豐度(圖4b)。這可能是因為在山東地區少有愛德華氏菌屬的存在，不易在淡水魚類中定植，或者山東地區的淡水魚中存在某些抑制該菌屬生長的條件。

圖4 各組中4種有益菌的相對豐度和5種有害菌的相對豐度Fig.4 Relative abundance of four beneficial bacteria and five harmful bacteria in each groups(a)HJ、SJ、HC、SC、HL和SL組中4種有益菌的相對豐度；(b)HJ、SJ、HC、SC、HL和SL組中5種有害菌的相對豐度(a)Relative abundance of four beneficial bacteria in HJ, SJ, HC, SC, HL and SL groups;(b)Relative abundance of five harmful bacteria in HJ, SJ, HC, SC, HL and SL groups

3 討論

本研究36個樣本包含3個淡水魚類品種，分別是草魚，鯽魚和鯉魚。在腸道微生物豐度分析中，除了SC組的變形菌門相對豐度不在前四，其他各組的魚腸道微生物均以變形菌門，梭桿菌門，硬壁菌門和擬桿菌門為主，同一菌門包含許多菌種，菌門的豐度大小受菌種豐度大小的直接影響，不同的環境可影響菌種豐度，菌門豐度也隨之發生改變。SC組中物種相對豐度排第四的是螺旋體，在HC組中也存在一定豐度的螺旋體，且少數螺旋體具有降解纖維素的能力[15,16]，如嗜熱螺旋體。草魚是一種典型的草食性魚類，腸道較長，需要更多的纖維素降解細菌來有效的攝取營養，因此推測本研究中的兩個草魚組均富含有較多螺旋體的原因與其腸道消化有關。許多優勢菌群對宿主的生長代謝至關重要，如硬壁菌門的芽孢桿菌屬可提高消化酶活性，變形菌門中的假單胞菌可抑制弧菌生長，它們共同作用維持腸道環境穩定。在LEfSe分析中，HJ組中氣單胞菌屬的相對豐度遠高于SJ組，SC組和SL組的差異物種都是弧菌科，可見，相比于山東水環境，氣單胞菌屬更易定植在湖南水環境的鯽魚腸道中，而弧菌更易在山東水環境的草魚和鯉魚腸道中定植。

有報告指出，食草性魚類腸道微生物群的數量隨季節變化而變化，在更密集的喂養季節(如夏季)微生物數量更高，這是因為夏季營養物質更多，環境溫度更高，有利于微生物的增殖[17]。然而本研究與以上研究的結論不同，兩地氣溫差異并未造成腸道菌群豐富度的明顯改變，可能是因為采樣的時間為八月份，雖然北方整體氣溫要比南方低，但是兩地氣溫都在適宜微生物生長的區間內，所以腸道中物種豐富度和均勻度無顯著差異。進行β多樣性比較時，SC組和HC組的組間差異大于組內差異，這可能是受到外界環境因素綜合的影響。很多環境因子都能夠對腸道微生物產生不同的影響[13,18]，湖泊中常常不可避免的存在農藥和重金屬污染問題，比如殺蟲劑五氯酚和抑霉唑均會顯著地引起魚體腸道菌群成分變化[19]，鉛和鎘會造成腸道菌群結構的變化[20,21]，水體中氨氣濃度影響魚類腸道微生物群落結構，過量硝酸鹽或氨氮還會損害宿主免疫功能[8]。本試驗兩湖泊所處地區不同，也必定存在不同的水質和環境問題，組間差異大于組內差異的試驗結果能夠反映環境差異對魚類腸道菌群的影響，但還無法將具體的環境因子與造成的差異結果一一對應。

本研究中選取的是生長狀況良好的淡水魚，在各組腸道環境中都存在一定豐度的病原菌，但并未表現出病理特征。魚類體內存在免疫系統，當遭受少量病原菌侵害時，魚體免疫機制會起到保護作用，調節腸道環境，抵制病原體入侵。當致病菌達到一定條件會爆發魚類疾病，給養殖業帶來損失。使用抗生素是魚類養殖部門控制疾病暴發的常見做法，然而抗生素的使用并非長久之計，耐藥菌的出現迫使研究者尋找新的抗生素替代品。有研究表明中草藥提取物可以對魚類的生長繁殖有益，如紫蘇籽提取物可以顯著提高水產動物的生長和飼料利用率[22]。但是中草藥的使用也存在一些效果不明顯且成本較高的難題，因此魚類益生菌的篩選是也逐漸成為了學者研究的熱點。潛在益生菌一般都具有非致病性，可調節腸道酸堿平衡，抑制病原菌生長，并通過不同途徑調節免疫[23]，飼喂乳桿菌能夠顯著提高牙鲆的免疫細胞吞噬活性和溶菌酶活性[23,24]，日糧中補充鏈霉菌增強了草魚免疫基因的表達，雙歧桿菌可提高腸上皮組織完整性[25]，枯草芽孢桿菌作為飼料補充劑可以增強石斑魚的固有免疫，降低虹膜病毒感染的死亡率[23,26]。有學者的研究報告中顯示鯽魚的芽孢桿菌屬相對豐度在(0.308 2±0.526 4)%，氣單胞菌屬和希瓦氏菌屬的相對豐度分別為(0.039 1±0.038 8)%和(0.121 1±0.104 9)%[27]，本試驗中芽孢桿菌屬的豐度在該區間內，各組的希瓦氏菌屬均高于該區間。雖然受到不同豐度的有害菌影響，定植在腸道中的鏈霉菌、乳桿菌、芽孢桿菌和雙歧桿菌可能通過增強魚的固有免疫抵抗有害菌的入侵，保證魚體的正常生命活動。

本研究可以為淡水養殖業提供重要的理論參考，通過進行不同地方同一品種淡水魚的腸道微生物分析可以看出，α多樣性比較無顯著差異，宿主自身因素對腸道菌群起主要調節作用。HC和SC組的組間差異大于組內差異，可能是受環境差異影響。潛在有益菌和潛在致病菌在腸道內存在某種平衡，雖然相對豐度不一樣，但并未致病。因此，為了保持腸道微生物間的平衡，后續還需要進行更多的研究，從中尋找和制造更多的有益因素，減少有害因素的出現頻率，創造更大的收益。