微波加熱法用于竹葉水提取總黃酮的應(yīng)用研究

黃 皓

（新平縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測站，云南新平 653400）

目前進(jìn)行竹葉黃酮類物質(zhì)的提取方法很多，有微波、超聲波輔助有機試劑、回流等常用提取方法。本文采用提取竹葉中的黃酮類量為指標(biāo)，參考比較三種提取方法，并設(shè)計單因素實驗研究實驗最佳條件，以期篩選出提取黃酮類物質(zhì)最快、最優(yōu)、最經(jīng)濟(jì)環(huán)保的實驗方法，為植物樣品提取黃酮類物質(zhì)提供參考。

本試驗主要是以去離子水為提取液的微波法浸提竹葉總黃酮，同時進(jìn)行微波提取單因素條件變量對比研究，總結(jié)出提取竹葉總黃酮的最佳工藝。微波法相比較其他提取方法有實驗裝置簡單方便、實驗過程簡單、提取率較高、時間短、提取劑經(jīng)濟(jì)易得、整個實驗經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)點。

1 材料與方法

1.1 供試材料

竹葉采自新平縣花山大廟百竹林，自然風(fēng)干備用。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器

ME204E電子天平、高速藥物粉碎機、HH-S11電熱恒溫水浴鍋、回流管、蒸餾燒瓶、WD900G型微波爐、801型磁力攪拌器、電爐、500 mL大燒杯、布氏漏斗、抽濾瓶、抽濾機、移液槍、超聲池、721型紫外可見分光光度計、超純水儀、60目篩。

1.2.2 試劑

蘆丁、95 % 乙醇、 甲醇、石油醚、NaNO2、AL（NO3）3、NaOH等試劑均為分析純，去離子水有超純水儀制備。

1.3 樣品預(yù)處理

將自然曬干的竹葉洗凈并烘干，用高速藥物粉碎機粉碎，再經(jīng)過60目篩，取得竹葉粉備用。

1.4 竹葉總黃酮不同提取方法

1.4.1 微波提取法

準(zhǔn)確稱取5 g竹葉粉，按固液比1 ∶ 20去離子水，浸泡20 min（期間用磁力攪拌器攪拌5 min），再放入設(shè)定好功率和時間的微波爐中進(jìn)行輻射后，經(jīng)抽濾機抽濾過濾，濾液移置250 mL容量瓶，用去離子水定容刻度并搖勻，取樣分析化驗（用3倍的石油醚萃取3次取下層溶液，下層溶液進(jìn)行定量分析測定）。

1.4.2 超聲提取法

準(zhǔn)確稱取5 g 竹葉粉，放入50 mL比色管中，將比色管放入1000 mL大燒杯中加入一定量水，放入超聲池中，按料液比1 ∶ 30（如碎竹葉取1 g，則所用甲醇溶液為30 mL）濃度為60 %的甲醇溶液進(jìn)行提取。提取時間為1 h，超聲池頻率為53 Hz，超聲后得到提取液和殘質(zhì)進(jìn)行減壓抽濾，濾液取樣分析化驗（用3倍的石油醚萃取3次取下層溶液，下層溶液進(jìn)行定量分析測定）。

1.4.3 回流提取法

準(zhǔn)確稱取5 g竹葉粉,置于100 mL燒瓶中,以料液比為1 ∶ 20的60 %甲醇液回流提取1 h，經(jīng)過濾取其濾液進(jìn)行萃取（用3倍的石油醚萃取3次取下層溶液）濃縮（到總體積1/3），將濃縮液移于50 mL的容量瓶加水定容至刻度,得樣品溶液定量分析測定。

1.5 竹葉黃酮的純化

1.5.1 乙酸乙酯萃取法

首先取100 mL定容液，用石油醚萃取3次（取下層溶液），將萃取液在70℃熱水液上加熱20～30 min。加熱后的溶液再用乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯液（減壓蒸去溶劑）濃縮液（到總體積1/3），濃縮后的溶液再用乙醇溶解過濾，最后用乙醇定容至50 mL，用于黃酮含量測定。

1.5.2 拌聚酰胺法

首先取50 mL定溶液，用石油醚萃取3次（取下層溶液），萃取得到的溶液在70℃熱水液上加熱，將加熱后的溶液減壓濃縮（到總體積1/3），然后在濃縮液中拌入聚酰胺靜置20 min，接著將含黃酮的聚酰胺用95 % 的乙醇萃取至無黃酮，再對萃取溶液進(jìn)行減壓濃縮，最后定容至50 mL容量瓶，用于黃酮含量測定。

1.6 竹葉中黃酮的測定

1.6.1 對照品溶液的繪制

準(zhǔn)確稱取蘆丁樣品15 mg，放于10 mL量瓶，加入60 % 乙醇溶解并定容至刻度并搖勻，于4 ℃冰箱中保存。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確吸取對照品溶液0 mL、0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.25 mL， 分 別 置 于 10 mL量瓶中。每組對照品中分別加入0.25 mL 5 %NaNO2溶液放置3 min，接著加入0.2 mL 10 % AL（NO3）3溶液并搖勻溶液，再放置3 min，再加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液，最后加水至5 mL并搖勻，放置10 min。并以去離子水作為參比，最后于510 nm波長處測定其吸光度。

1.6.3 黃酮含量的測定

準(zhǔn)確吸取黃酮提取液1 mL，分別置于10 mL量瓶中。黃酮提取液中加入0.25 mL 5 % NaNO2溶液放置3 min，接著加入0.2 mL 10 % AL（NO3）3溶液并搖勻溶液，再放置3 min，再加入2 mL 1mol/L NaOH溶液，最后加水至5 mL，搖勻，放置10 min。最后于510 nm波長處測定其吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出竹葉黃酮提取液中黃酮的濃度。

1.7 不同提取方法總黃酮提取率比較

1.7.1 不同方法竹葉黃酮地提取

分別用去離子水作溶劑的微波提取法、60 %甲醇溶液作溶劑的超聲提取法、回流提取法來提取竹葉中的黃酮。得到黃酮粗提取液后再經(jīng)過減壓蒸去溶劑濃縮溶液（到總體積1/3），將濃縮液轉(zhuǎn)移到干鍋中繼續(xù)高溫濃縮，直到溶液變?yōu)楣腆w粉末，得到粉末狀黃酮粗提物。

1.7.2 黃酮提取率的測定

總之，企業(yè)財務(wù)會計風(fēng)險管理是企業(yè)生產(chǎn)運營過程中不可或缺的必要工作內(nèi)容，對增強企業(yè)抵御風(fēng)險的能力，提高企業(yè)財務(wù)管理水平等方面，有著十分重要的現(xiàn)實意義。因此，各個企業(yè)必須充分了解自身財務(wù)會計風(fēng)險的類型，深刻認(rèn)知財務(wù)會計風(fēng)險管理中存在的問題，不斷優(yōu)化資產(chǎn)結(jié)構(gòu)，完善內(nèi)部控制制度，構(gòu)建完善的風(fēng)險監(jiān)督體系，并建立健全風(fēng)險評估機制，從而促進(jìn)企業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

準(zhǔn)確稱取經(jīng)不同提取方法（微波、超聲、回流）提取得到的黃酮粗物3 mg，分別置于10 mL量瓶中，然后加入60 %乙醇溶解并定容到刻度，搖勻溶液。再用移液槍準(zhǔn)確移取各黃酮樣品1 mL，分別置于10 mL量瓶中，在各樣品中分別加入0.25 mL 5 % NaNO2溶液放置3 min，接著加入0.2 mL 10 % AL（NO3）3溶液并搖勻溶液，再放置3 min，再加入2 mL 1mol/L NaOH溶液，最后加水至5 mL并搖勻，放置10 min。最后于510 nm波長處測定其吸光度，將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出竹葉黃酮粗提產(chǎn)品中黃酮的含量。

1.8 微波法提取竹葉總黃酮影響因素的研究

1.8.1 微波時間的影響

準(zhǔn)確稱取5 g竹葉粉，置于500 mL燒杯中，以水作為溶劑。按料液比為1 : 20的比例加入去離子水100 mL，將微波爐的微波功率調(diào)至400 w，根據(jù)微波時間的不同，樣品分別在時間為1 min、2 min、3 min、4 min條件下進(jìn)行竹葉中黃酮地提取。

1.8.2 微波功率的影響

準(zhǔn)確稱取5 g竹葉粉，置于500 mL燒杯中，以水作為溶劑。按料液比為1 : 20的比例加入去離子水100 mL，將微波作用時間調(diào)至2 min，根據(jù)微波功率的不同，樣品分別在微波功率為100 w、200 w、300 w、400 w、500 w條件下進(jìn)行竹葉中黃酮地提取。

1.8.3 固液比的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法總黃酮的含量

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

本實驗采用分光光度法測定竹葉中總黃酮的含量，就需要選則一個標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用標(biāo)準(zhǔn)溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過和標(biāo)準(zhǔn)曲線地對比計算其含量。此次實驗以蘆丁溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以吸光度為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得吸光度與濃度有很明顯的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y = 1.6678 X + 0.0070 R2= 0.9995

2.1.2 微波法提取竹葉總黃酮影響因素的結(jié)果

由圖1知，黃酮的提取量隨著提取時間增加而升高，但到3 min左右后，增加趨于平緩，并隨著時間增加有下降趨勢。可能是提取溫度過高而破壞了黃酮的結(jié)構(gòu)，使黃酮分解，由此得出微波時間最佳為3 min。

由圖2知，隨著微波功率地升高黃酮提取量也逐漸升高，當(dāng)微波功率到達(dá)400 w時黃酮提取量達(dá)到最高，如果繼續(xù)提高功率則黃酮的提取量將下降。由此得微波功率最佳為400 w。

由圖3知，黃酮提取量隨著竹葉與水溶劑比例的減小而增加，當(dāng)固液比為1 ∶ 30時黃酮提取量達(dá)到最大，并隨著比值的繼續(xù)減小呈現(xiàn)出減小的趨勢。由此得出固液比最佳為1 ∶ 30。

因此通過以去離子水作為溶劑的微波法提取竹葉總黃酮單因素實驗條件的對比，最終得出最佳的提取工藝條件是：竹葉粉5 g、水為提取溶劑、固液比為1∶ 30、微波功率400 w、微波時間3 min。

2.2 不同提取方法的竹葉黃酮提取率（見表1）

竹葉總黃酮提取分別是微波法、超聲法、回流法。經(jīng)過對提取液進(jìn)行分離和濃縮純化后得粗提樣品，并對三種不同的方法提取得到粗提樣品進(jìn)行總黃酮含量的測定比較。通過測得竹葉黃酮提取液的吸光度，將吸光度值帶入方程Y = 1.6678 X + 0.0070可以算出竹葉中總黃酮的含量。

總黃酮提取率 = 提取液中總黃酮的含量 / 竹葉原料的重量 × 100 %

粗品中總黃酮含量 = 總黃酮的濃度 × 250 mL/原料重量

經(jīng)實驗研究對比表明：

一是以去離子水作為提取劑的提取方法中微波提取法（50 %）的提取率大于回流提取法（49 %）。

二是以去離子水作為提取劑的微波法和以60%甲醇作為提取劑的超聲法的提取率比較得出兩種方法的提取率只相差1 % 。

三是作為提取劑的比較，甲醇具有一定的毒性，同時揮發(fā)性強，市場價格較高，而去離子水無毒性，易得無揮發(fā)性，并且經(jīng)濟(jì)環(huán)保。作為提取方法對比，超聲提取的過程時間一般為1 ～ 2 h，而微波提取的過程時間一般為20 ～ 30 min。

表1 不同提取方法的黃酮提取率比較

因此，實驗研究對比得出：最快、最優(yōu)、最經(jīng)濟(jì)環(huán)保實驗條件為以去離子水作為提取劑的微波提取法。微波提取法是利用了微波能來提高竹葉黃酮提取效率的一種高新技術(shù)，與超聲法、回流法相比較，具有設(shè)備簡單、時間短、重現(xiàn)性好、提取效率高、經(jīng)濟(jì)環(huán)保等特點，達(dá)到強化與優(yōu)化傳熱傳質(zhì)的目的。

3 結(jié) 論

首先，通過對不同溶劑（水、乙醇、甲醇）、不同提取方法（微波、超聲、回流）地對比研究，找到了最佳的提取方法是以水作為溶劑的微波提取法。相比較其他方法具有提取率較高、時間短、實驗簡單環(huán)保的優(yōu)點。其次研究了微波提取法中的單因素條件對竹葉總黃酮提取量的影響，分別對比研究了不同時間、不同功率、不同固液比條件下的總黃酮的提取量，表明實驗條件是：3 min 為最佳條件的微波時間，最佳的固液比為1 ∶ 30，最佳微波功率為400 w 。