重組GSTA3 蛋白對福美雙誘導(dǎo)的TD 肉雞生長性能的影響

楊世雄，李 楨，郭 敏，寧官保，張 鼎，田文霞

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.晉城市科學(xué)技術(shù)局，山西晉城048000）

肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良（Tibial Dyschondroplasia，TD）常發(fā)生于快速生長的肉雞中，是一種嚴(yán)重的骨骼性疾病，在1965 年被LEACH 等[1]發(fā)現(xiàn)。TD的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，致病機(jī)理尚沒有被研究者研究清楚。

福美雙別名秋蘭姆，是一種廣泛應(yīng)用于植物殺菌的低毒殺菌劑，此外也可作為橡膠生產(chǎn)中的促進(jìn)劑。有研究表明，飼料中添加福美雙，可大面積誘發(fā)TD[2]。田文霞等[3-5]也使用福美雙成功誘發(fā)TD，發(fā)病率高達(dá)94.44%，明顯優(yōu)于其他因素，經(jīng)過深入分析病雞的生長性能、病理組織變化等，發(fā)現(xiàn)與自然發(fā)病基本一致，可以作為理想的TD 模型，為TD 機(jī)理研究提供了穩(wěn)定、可靠的病理模型。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-Transferase，GSTs）是1 個(gè)超家族，廣泛存在于各種植物動物微生物體內(nèi)，是主要的II 期解毒酶，在防御各種環(huán)境毒物和氧化應(yīng)激中起著核心作用，可以催化多種化學(xué)物質(zhì)與谷胱甘肽巰基結(jié)合，使其易于排泄，以達(dá)到將有毒物質(zhì)排出體外的目的。田文霞等[6]采用基因芯片技術(shù)分析各種相關(guān)基因在TD 肉雞脛骨中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在肉雞發(fā)生TD 時(shí)，GSTA3 基因顯著表達(dá)，在使用福美雙構(gòu)建的TD 模型中，GSTA3 在第1 天表達(dá)上調(diào)，第2 天和第4 天表達(dá)下調(diào)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在TD 發(fā)生時(shí)，有類固醇的參與，而該家族是人類已知的催化效率最高的類固醇異構(gòu)酶，GSTA3 是該家族成員之一，GSTA3 在類固醇生成組織中選擇性表達(dá)，在類固醇類激素的合成中起到了重要作用[7-10]。這提示在TD 發(fā)生時(shí)，GSTA3 可能會起到重要的作用。

本研究利用福美雙構(gòu)建肉雞TD 模型，之后分別用低劑量的GSTA3 蛋白和高劑量的GSTA3 蛋白對TD 肉雞腿部肌肉進(jìn)行注射，定期稱取肉雞質(zhì)量，探究其對肉雞生長性能的影響，旨在為后續(xù)肉雞TD 的有效治療提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試120 羽1 日齡艾維茵肉雞購于山西省大象農(nóng)牧集團(tuán)有限公司；福美雙購自美國life 公司；PBS 緩沖液購自北京索萊寶公司；表達(dá)重組GSTA3蛋白的大腸桿菌由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院生物制品實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 重組GSTA3 蛋白的表達(dá)純化

將GSTA3 大腸桿菌接種于LB 固體培養(yǎng)基（加卡那霉素），置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～14 h，挑取單菌落接種于100 mL 液體LB 培養(yǎng)基（加卡那霉素）中，置于搖床中14 h，轉(zhuǎn)接到大瓶液體LB 培養(yǎng)基（加卡那霉素）中培養(yǎng)，2～3 h 后，OD600達(dá)到0.4～0.7 時(shí)加入IPTG 誘導(dǎo)21 h，然后4 ℃離心洗菌，于冰上超聲破碎細(xì)菌，菌液以達(dá)到透亮為標(biāo)準(zhǔn)，用0.45 μm 濾器過濾，4 ℃保存。利用鎳柱親和層析方法純化蛋白，之后透析，濃縮，使用BCA 試劑盒測定重組GSTA3 蛋白的濃度，待用。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2017 年7 月開始，在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。艾維茵肉雞按照常規(guī)方法飼養(yǎng)管理7 d 后分組，每組20 只肉雞，共分6 組，分別為A 組（對照組）.飼喂基礎(chǔ)日糧，注射4 次PBS；B組.飼喂基礎(chǔ)日糧，注射4 次GSTA3 蛋白（20 μg/kg）；C組.飼喂基礎(chǔ)日糧，注射4 次GSTA3 蛋白（50μg/kg）；D 組.在基礎(chǔ)日糧中添加福美雙（100 mg/kg），注射4 次PBS；E 組.在基礎(chǔ)日糧中添加福美雙（100mg/kg），注射4 次GSTA3 蛋白（20 μg/kg）；F 組.在基礎(chǔ)日糧中添加福美雙（100 mg/kg），注射4 次GSTA3 蛋白（50 μg/kg）。按照文獻(xiàn)[5]和文獻(xiàn)[11]的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用福美雙誘導(dǎo)TD，在第8、9 日齡分別添加福美雙日糧，之后換成正常基礎(chǔ)日糧，分別在第8、10、12、14 日齡注射重組GSTA3 蛋白或PBS，注射部位均為腿部肌肉。在第12、14、18、23 日齡每組隨機(jī)取5 只，稱取質(zhì)量，計(jì)算其平均增質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSTA3 蛋白對肉雞增質(zhì)量的影響

從表1 可以看出，在12～14 日齡，D、E、F 組的雞只增質(zhì)量顯著低于A、B、C 組，表明TD 嚴(yán)重影響了肉雞的增質(zhì)量；在14～18 日齡和18～23 日齡，F(xiàn)組與A、B、C 組的雞只增質(zhì)量無顯著差異，說明GSTA3 蛋白對TD 肉雞的增質(zhì)量恢復(fù)有較好的作用，且有劑量依賴性。每個(gè)時(shí)段C 組與A、B 組都無顯著差異，表明GSTA3 蛋白對正常肉雞的增質(zhì)量沒有影響。

表1 體質(zhì)量變化平均值 g/只

2.2 GSTA3 蛋白對肉雞癥狀表現(xiàn)的影響

在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，10 日齡的TD 組臨床癥狀較為明顯，小雞精神萎靡，久臥不愿走動，站立不穩(wěn)。12 日齡TD 組癥狀加劇，大部分小雞精神差，跛行，脛骨關(guān)節(jié)處腫大，運(yùn)動困難，劈叉。14 日齡和12 日齡癥狀相似，TD 肉雞進(jìn)食較少，增質(zhì)量明顯低于對照組。從14～18 日齡，能明顯發(fā)現(xiàn)，注射了高劑量蛋白的TD 肉雞精神逐漸恢復(fù)，大部分雞逐漸能夠走動進(jìn)食，增質(zhì)量也明顯增加，與對照組已無差異。從18～23 日齡，注射了低劑量和高劑量蛋白的TD 肉雞精神已經(jīng)恢復(fù)，大部分雞已經(jīng)恢復(fù)正常采食，增質(zhì)量也恢復(fù)到與對照組無差異，且從數(shù)據(jù)上看，注射了高劑量蛋白的組比低劑量的組增質(zhì)量更明顯，說明蛋白對生長有一定的促進(jìn)作用。

3 結(jié)論與討論

肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良（Tibial Dyschondroplasia，TD）常發(fā)生于快速生長的肉禽。該病會導(dǎo)致肉雞生長緩慢，運(yùn)動困難，進(jìn)而導(dǎo)致肉品質(zhì)的下降，同時(shí)也會帶來動物福利問題。該病導(dǎo)致禽類脛骨關(guān)節(jié)腫大，跛行，精神沉郁，由于運(yùn)動受限導(dǎo)致采食，飲水困難，生長性能降低[12]。癥狀嚴(yán)重的常見久臥不起，精神極差，導(dǎo)致肉品質(zhì)和產(chǎn)量下降。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶是參與機(jī)體解毒的一個(gè)關(guān)鍵酶。其可以催化各種有毒化學(xué)物質(zhì)，緩解其毒性，如殺蟲劑、藥物、重金屬等外源化合物、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、4-羥基壬烯酸（4HNE）和丙烯醛等內(nèi)源化合物[13-16]。GSTA3 是GSTs 超家族中的一個(gè)成員，目前對于GSTA3 的研究報(bào)道還很少，在人類的cDNA 文庫中發(fā)現(xiàn)了該基因，表明GSTA3 可能在一些特殊的發(fā)育調(diào)控中起一定的作用[17]。劉紅霞[18]在福美雙誘導(dǎo)構(gòu)建的TD 肉雞模型中，使用cDNA 芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)GSTA3 可能參與代謝細(xì)胞色素P450，清除毒性物質(zhì)。其他研究也發(fā)現(xiàn)，福美雙會影響肝臟導(dǎo)致其解毒功能降低[19]，且福美雙導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡與異常的谷胱甘肽代謝有顯著關(guān)聯(lián)，而GSTs 可以調(diào)節(jié)該異常反應(yīng)，維持機(jī)體的正常解毒[20]。

目前，GSTA3 在肉雞TD 發(fā)生過程中的作用研究還很少，本試驗(yàn)證明了重組GSTA3 蛋白對TD 肉雞增質(zhì)量有恢復(fù)作用。本試驗(yàn)未從其他方面評估其生長性能的恢復(fù)，以后應(yīng)進(jìn)一步從飼料轉(zhuǎn)化率、免疫器官質(zhì)量等方面評估其生長性能。