豬繁殖與呼吸綜合征病毒山西分離株ORF7 基因序列分析

樊振華，劉文俊，武守艷，吳 忻，孟 帆，焦福林，薛翼鵬

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種高度傳染性疾病，臨床上以懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、木乃伊胎、死胎、產(chǎn)弱仔等繁殖障礙以及仔豬嚴重呼吸道癥狀和高死亡率為特征[1]。1987 年美國首次報道發(fā)生豬繁殖與呼吸綜合征，1991 年荷蘭首次分離出該病病毒[2]，我國在1996 年首次從國內(nèi)疑似PRRS 感染豬群中分離到PRRSV[3]。PRRSV 可分為以VR-2332 毒株為代表的美洲型和以Lelystad Virus（LV）毒株為代表的歐洲型，美洲型和歐洲型之間的核苷酸同源性為60%左右[4]。PRRSV 的基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，基因組全長約15 kb，含9 個相互重疊的開放閱讀框（openreadingframe，ORF），即ORF1a、ORF1b、ORF2a、

ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6 和ORF7[5-7]，其中，由ORF7 基因編碼的核衣殼（N）蛋白相對保守，是PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白中含量最高的蛋白，具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，在病毒組裝和釋放中發(fā)揮重要作用[8-9]，因此，ORF7 基因是檢測PRRSV 的重要靶基因，N 蛋白是進行PRRS 血清學(xué)檢測的重要靶蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，不同PRRSV 毒株的ORF7基因序列之間有一定的差異性，這是應(yīng)用ORF7 基因為靶基因、N 蛋白為靶蛋白對PRRSV 進行檢測、診斷時需要考慮的重要因素。

本研究通過對山西地區(qū)檢測的陽性樣品的ORF7 基因序列進行分析，研究ORF7 基因的遺傳變異情況，為研制PRRS 檢測試劑盒提供參考，為山西地區(qū)PRRS 的綜合防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試病料 供試材料為在山西省太原、長治、晉中等豬場無菌采集感染PRRSV 的發(fā)病豬的肺、扁桃體、脾、淋巴結(jié)、流產(chǎn)胎兒等組織，經(jīng)RT-PCR 鑒定為PRRSV 陽性，-80 ℃保存。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus、Premix Taq、DNA Marker DL2000、PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit、pMD18-T vector 等購自寶生物（大連）工程有限公司；SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒、SanPrep 核酸純化套件（質(zhì)粒提取）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；E.coli DH5α 菌株購自天根生物科技（北京）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 用DNAStar 軟件對GenBank 中PRRSV 的ORF7 基因進行序列分析，設(shè)計出擴增ORF7 基因的引物，預(yù)期長度為411 bp。引物序列為：ORF7-F：5′-GCTGTTAAACAGGGAGTGG Y-3′，ORF7-R：5′-GAGGCATCTCAGTGTTTGAA-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 病毒總RNA 提取 按照RNAiso Plus 說明書操作，從PRRS 陽性病料中提取總RNA，用50 μL 0.1%DEPC 水溶解，-70 ℃保存。

1.2.3 PRRSV ORF7 基因RT-PCR 擴增、克隆與測序 以提取的RNA 為模板制備cDNA，按照Prime-ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 操作說明進行。在PCR 管中依次加入RNase free H2O7 μL、dNTP 1 μL、模板1 μL，ORF7-R 1 μL，混勻，65 ℃保溫5 min 后，在冰上迅速冷卻。在上述的PCR 管中依次加入RNase free dH2O 4.5 μL、5×PrimeScript II Buffer 4 μL、PrimeScript ⅡRTase 1 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL。PCR 反應(yīng)體系：Premix Taq 25 μL、滅菌蒸餾水21 μL、cDNA 模板2 μL、ORF7-F 和ORF7-R各1 μL，混勻。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR 擴增產(chǎn)物10 μL，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果。將回收后的PCR 產(chǎn)物連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5a 感受態(tài)細胞，經(jīng)鑒定的陽性菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.3 序列分析

用DNAstar 軟件將獲得的2 個PRRSV的ORF7基因序列與GenBank 中收錄20 株P(guān)RRSV 的ORF7基因序列進行同源性比較并構(gòu)建進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRRSV ORF7 基因的RT-PCR 擴增結(jié)果

以PRRS 陽性病料中提取的總RNA 為模板，用ORF7-F 和ORF7-R 進行RT-PCR 擴增，獲得與預(yù)期大小一致的特異性片段，大小約411 bp（圖1）。

2.2 ORF7 基因序列變化

獲得2 個PRRSV ORF7 基因全長均為372 bp，無核苷酸插入和缺失。與VR-2332 毒株相比，2 株P(guān)RRSV 山西分離株ORF7 基因有25 個相同的核苷酸突變，分別為：8、126、137、143、192、234、255 位核苷酸由A→G，27、43、72、96、264、291 位由G→A，93、165、186、210、249、350 位由T→C，108、243、270、339 位由C→T，321 位由T→G，327 位由T→A。另外，CH_SXXG2_2015 的269 位由G→T。

2 個PRRSV ORF7 基因推導(dǎo)的氨基酸與VR-2332 相比，有6 個相同的氨基酸突變，分別為：第3 位氨基酸由N→S，第15 位由D→N，第46、48 位由K→R，第109 位由H→Q，第117 位由V→A。另外，CH_SXXG2_2015 的90 位由C→F。

2.3 ORF7 基因同源性分析

2 個PRRSV 毒株的ORF7 基因之間的核苷酸同源性為99.7%、氨基酸同源性為98.4%，與歐洲型代表毒株LV 核苷酸和氨基酸同源性分別為65.9%和58.1%，與美洲型代表毒株VR-2332 的核苷酸和氨基酸同源性分別為93.0%～93.3%和93.5%～94.4%，與高致病性PRRSV 變異毒株（JXA1、HUN4、HEB1、HUB1）核苷酸和氨基酸的同源性分別97.6%～98.1%和95.2%～96.0%，與我國早期分離毒株CH-1a 核苷酸和氨基酸的同源性分別為94.6%～94.9%和91.9%～92.7%。

2.4 ORF7 基因的遺傳進化分析

根據(jù)獲得的2 個PRRSV ORF7 基因與Gen-Bank 中收錄的20 株P(guān)RRSV ORF7 基因構(gòu)建的進化樹可知，PRRSV 毒株分為歐洲型和美洲型2 個基因型，歐洲型代表毒株LV 單獨為一群，與其他毒株距離都很遠；2 個PRRSV 毒株的ORF7 基因與美洲型代表毒株VR-2332 親緣關(guān)系較近，與其他參考毒株同屬于美洲型。美洲型又可分為2 個亞群，其中，第1 亞群包括BJ-4、VR-2332、HN1 和我國2006 年以后分離的4 株（GZ1101、HZ-31、HNyc15、QY2010）；本 研 究 獲 得 的 2 個 ORF7 基 因（CH_SXLF7_2015、CH_SXXG2_2015）和 CH-1a、HB-2（sh）、我國2006 年以后分離的10 株（JXA1、SD-09、HUB1、HEB1、HUN4、Henan-A14、GD、GDQY2、GZgy15-1、GD-2011）組成第2 亞群（圖2）。

3 結(jié)論與討論

由ORF7 基因編碼的N 是PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白中含量最高的蛋白，具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。因此，ORF7 是檢測病毒的重要靶基因，N 蛋白是進行血清學(xué)檢測的重要靶蛋白。

2 個PRRSV 山西分離毒株ORF7 基因之間的核苷酸和氨基酸同源性分別為99.7%和98.4%，與美洲型代表株VR-2332 核苷酸和氨基酸同源性分別為93.0%～93.3%和93.5%～94.4%，與歐洲型代表毒株LV 核苷酸和氨基酸同源性分別為65.9%和58.1%，與高致病性PRRSV 核苷酸和氨基酸同源性分別為97.6%～98.1%和95.2%～96.0%。遺傳進化樹分析結(jié)果表明，2 個PRRSV 山西分離毒株ORF7與歐洲型代表毒株LV 親緣關(guān)系較遠，與美洲型代表毒株VR-2332 親緣關(guān)系較近，與CH-1a、HB-2（sh）、我國2006 年以后分離的10 株（JXA1、SD-09、HUB1、HEB1、HUN4、Henan-A14、GD、GDQY2、GZgy15-1、GD-2011）屬于同一亞群。氨基酸變異分析結(jié)果表明，2 個PRRSV 山西分離毒株ORF7 基因與VR-2332 相比發(fā)生散在的點突變。大多數(shù)N 蛋白單抗識別N 蛋白中心區(qū)域第52—69 位氨基酸的序列[11]，山西省的2 個PRRSV 分離毒株在第52—69 位氨基酸之間沒有發(fā)生變異，因此，針對N 蛋白建立的多種檢測方法目前仍具有實用性。由于RNA 病毒不斷變異，應(yīng)該及時檢測PRRSV 的變異情況，對PRRSV 檢測方法不斷進行研究，為PRRSV 的預(yù)警防控打好基礎(chǔ)。