狗頭棗果實生長過程中保護酶活性變化規律

白永宏，趙贊延，王亞潔，李金憶，趙 鋒，陳國梁，3

（1.延安職業技術學院，陜西延安716000；2.延安大學生命科學學院，陜西延安716000；3.陜西省紅棗重點實驗室，陜西延安716000）

紅棗（Zizyphus jujube Mill）屬于鼠李科棗屬植物，為我國獨有樹種，至今已有超過3 000 a 的栽培歷史[1]。紅棗富含多種礦物質元素，營養價值高，適口性好，是百果之王，深受廣大消費者青睞。然而，棗成熟期短而且集中，又極不耐貯運，產區常常出現成批鮮棗腐爛的情況。在自然狀態下，鮮棗采收后不易保鮮、不耐貯藏，果肉很快軟化變褐，常溫下容易代謝失常、腐爛和失水，常常會出現表面皺縮、果肉組織壞死、積累大量的乙醇等有害物質，棗果實的Vc 幾乎全被破壞，大大降低了棗果的營養價值，縮短了鮮棗市場的貨架期[2]，極大地限制了我國紅棗產業的發展。

本試驗研究了狗頭棗果實在棗果實生長過程中超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和過氧化氫酶（CAT）3 種保護酶活性，探討這3 種酶在棗果實成熟軟化中的作用及其相互關系，以期找到影響棗果實成熟軟化的關鍵酶類，掌握相關酶對棗果實生長發育、成熟軟化等機制的作用及規律，進一步闡明棗果實成熟軟化與衰老的酶學調控機制，更好地控制棗果實成熟軟化進程，提高耐貯性，為改善果實品質和完善貯藏保鮮技術提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究所用狗頭棗果實采自延安市寶塔區石家畔村。2018 年8 月5 日至9 月19 日每15 d 采樣一次，9 月20 日至10 月10 日每7 d 采樣一次。采樣方法：隨機采摘成熟度一致、大小均勻、無機械損傷和病蟲害的狗頭棗果實，用清水沖洗，當天用冰盒帶回實驗室，放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2 試驗方法

對狗頭棗果實樣品進行預處理：隨機從超低溫冰箱中取出每個時期的狗頭棗果實各10 顆，分時期處理，分別去皮去核切成小塊，混勻備用。

1.2.1 粗酶液的制備

1.2.1.1 SOD、CAT 粗酶液的制備 參考田昕等[3]的方法進行。稱取預處理過的不同時期的棗果實各4.0 g，置于預冷研缽中，加入10 mL 預冷的50 mmol/L pH 值7.8 的PBS 提取液，冰浴研磨至勻漿。裝入50 mL 離心管中，用20 mL 的PBS 沖洗研缽2 次，沖洗液亦轉入離心管中，于4 ℃以10 000 r/min離心20 min，所得上清液即為粗酶液，冰浴保存，用于測定SOD、CAT 活性，測定時取適量酶液稀釋5 倍。

1.2.1.2 APX 粗酶液的制備 參考張亞宏等[4]的方法進行。稱取預處理過的不同時期的棗果實各2.0 g，加入10 mL 預冷的50 mmol/L pH 值7.0 的PBS 提取液，冰浴研磨至勻漿，轉入50 mL 的離心管中，再加入10 mL 的PBS 沖洗研缽，沖洗液亦轉入離心管中，于4 ℃條件下15 000 g 離心15 min，收集所得上清液即為粗酶液，冰浴保存。

1.2.2 酶活性的測定

1.2.2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性測定 采用NBT 光化還原法[5]進行。試管中分別加入50 mmol/L的PBS 4.05 mL、220 mmol/L 的Met 溶液0.3 mL、1.25 mmol/L 的NBT 溶液0.3 mL、33 μmol/L 的核黃素溶液0.3 mL 和SOD 粗酶液0.05 mL（對照以緩沖液代替）。將上述試劑混勻后，置于4 000 lx 的光照培養箱中反應20 min。反應結束后，用黑布罩上試管，終止反應。最后在560 nm 波長下測定OD 值，以不照光的對照管作參比，分別測定其他各管的OD 值。以每克樣品抑制NBT 光化還原50%為一個酶活力單位（U）。

1.2.2.2 過氧化氫酶（CAT）的活性測定 參考張以順等[6]的方法進行。取CAT 粗酶液0.2 mL、pH 值7.8 的PBS 1.5 mL、蒸餾水1 mL，在25 ℃水浴鍋中預熱10 min 后，加入0.1 mol/L 的H2O20.3 mL，每加完一管立即計時，并迅速倒入石英比色杯中，在240 nm 波長下測定OD 值，每隔1 min 讀數1 次，共測4 min。以單位時間內（1 min）每克樣品使OD240減少0.1 為1 個酶活力單位（U）。

1.2.2.3 抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性測定在張亞宏等[4]方法的基礎上加以改進。在試管中加入磷酸緩沖液1.8 mL、AsA 溶液0.6 mL、APX 粗酶液0.1 mL、蒸餾水0.9 mL。在25 ℃水浴鍋中預熱10 min，再加入H2O20.6 mL，啟動反應，立即計時，并迅速倒入石英比色皿中，在290 nm 波長下測定OD 值，每隔1 min 讀數一次，共測4 min，以單位時間（1 min）內每克樣品使OD290變化0.1 定義為一個酶活力單位（U）。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2007 和Microsoft Power-Point 2007 軟件對試驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 超氧化物歧化酶（SOD）的活性變化

表1 棗果實生長過程中3 種保護酶的活性

從表1 和圖1 可以看出，棗果實幼果期超氧化物歧化酶（SOD）活性較高（411 U/g），到了青果期其活性急劇下降，低至186 U/g，從青果期到全紅期其酶活性又上升了1 倍多，最高達到398 U/g，全紅期后其酶活性快速下降到最小值129 U/g，在狗頭棗果實生長過程中SOD 活性整體呈先大幅度下降、后緩慢上升再下降至最低點的變化趨勢。其中，幼果期到青果期SOD 活性大幅度下降；泛紅期到半紅期，SOD 活性由257 U/g 增長到292 U/g，3 個生長階段活性只增加了35 U/g；全紅期到成熟期又呈現緩慢的下降趨勢。超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內清除自由基的關鍵保護酶之一，SOD 可清除細胞內過量的活性氧[7]。從試驗結果可知，SOD 在狗頭棗果實生長過程中酶活性是多變的，沒有規律。這可能與果實的生長環境密切相關，比如紫外線的影響，紫外線越強，超氧化物歧化酶的活性也就越強。

2.2 過氧化氫酶（CAT）活性的變化趨勢

由表1 和圖2 可知，在狗頭棗果實生長過程中CAT 活性呈緩慢上升再緩慢下降的趨勢，從幼果期（94 U/（g·min））到青果期（129 U/（g·min））、泛紅期（141 U/（g·min））、半紅期（169 U/（g·min））、全紅期（207 U/（g·min））4 個生長階段一直呈緩慢上升趨勢；從全紅期開始，到成熟期（195 U/（g·min））、完熟期（146 U/（g·min））活性又下降。進一步分析可看出，相比其他相關酶類，過氧化氫酶（CAT）活性整體變化幅度小，其最大值與最小值之差為113 U/（g·min）?？梢栽谝欢ǔ潭壬险f明，過氧化氫酶在狗頭棗生長過程中變化不大，對其生長生理影響不大。CAT 參與植物生長發育、逆境脅迫防御應答、氧化衰老等生理過程[8]，CAT 對狗頭棗果實的保護在全紅期最強，其他時期也具有一定的抗脅迫作用[9]。

2.3 抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的變化趨勢

由表1 和圖3 可知，棗果實抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性在幼果期較低（57 U/（g·min）），從幼果期到泛紅期含量幾乎沒有變化，從泛紅期到成熟期活性快速增高到峰值192 U/（g·min），之后又稍有下降，至完熟期降為173 U/（g·min），在狗頭棗果實生長過程中APX 活性整體呈上升趨勢。如果將泛紅期和完熟期視為偶然因素影響，那么整體來看，抗壞血酸過氧化物酶（APX）在狗頭棗果實生長過程中呈緩慢上升趨勢，即隨著生長時期的推進酶活性越來越高。因為APX 參與植物生長發育和多種逆境脅迫的響應過程，所以可以認為，APX 隨著狗頭棗的生長，保護作用越來越強。

3 結論與討論

超氧化物歧化酶（SOD）是一種含有金屬的抗氧化酶。它第一個在活性氧清除系統中發揮催化作用[10]，催化超氧陰離子（·O2-）進行歧化反應生成·O2-和H2O2，其作用是避免O2-自由基對細胞膜產生過氧化作用[11]。本研究中，棗果實的幼果期SOD 活性最高達到411 U/g，活性很高，這可能與細胞新陳代謝旺盛、細胞增殖分化快、細胞產生的活性氧多有關。青果期SOD 活性數值低至186 U/g，下降幅度較大，可能是SOD 與超氧陰離子自由基（·O2-）發生歧化反應，導致了·O2-濃度的下降，產生了大量的H2O2，造成SOD 的活性受到了較強抑制；青果期后期，由于APX 和CAT 的活性逐漸上升，清除了部分H2O2，導致抑制作用減弱，SOD 的活性又逐漸升高，到全紅期升至398 U/g；全紅期后，SOD 的活性下降較為顯著。這與赤小豆子葉[12]、蘋果果實[13]的研究結果是一致的。棗果實在成熟期后，由于逐漸成熟軟化，果實細胞衰老，細胞功能開始衰退，代謝產生的O2-積累得越來越多，達到一定程度后就會嚴重傷害細胞，使細胞SOD 基因表達減少，因此，SOD 的活性也就降低。

過氧化氫酶（CAT）是生物體內重要的清除H2O2的重要酶類之一，SOD 的產物是CAT 催化的底物[14]。CAT 催化H2O2的分解，生成H2O 和O2，阻斷O2在鐵螯合物作用下與H2O2反應，生成對植物有害的·OH[15]。因此，在活性氧清除系統中，CAT 是第2 類保護酶之一。在婆棗、龍山貢棗[3]、杜梨[16]等的研究中發現，棗果實生長發育過程中CAT 的活性變化有2 種類型，一種是升—降，另一種是降—升—降。在本研究中，棗果實的活性變化呈升—降類型，屬于單峰趨勢。在全紅期，過氧化氫酶（CAT）出現活性達到峰值207 U/（g·min），之后其活性呈現較顯著下降趨勢，與婆棗、龍山貢棗的研究結果相似，都在棗果實成熟期前后出現活性峰值。這種變化趨勢適應了棗果實成熟過程的生理變化，CAT活性的增高，活性氧的水平降低，保證了棗果實的生長發育正常進行，在棗果實發育成熟過程中發揮了重要的促進作用。

抗壞血酸過氧化物酶（APX）是葉綠體中專一性地清除H2O2的酶，參與活性氧清除系統的第2 步反應，催化AsA 與H2O2發生氧化反應，生成單脫氫抗壞血酸（MDAsA）[17]。高等植物中有胞質型和葉綠體型2 種類型的APX[18]。煙草[19]、大麥[20]等植物的葉片中含有的APX 活性較高，而本研究中，棗果實APX活性水平總體較低，幼果期較低（57 U/（g·min）），成熟期達到峰值（192 U/（g·min）），這可能與其葉綠體的含量相關。在植物細胞內，AsA 的氧化分解主要由APX 和抗壞血酸氧化酶（AAO）催化[21]。隨著棗果實的發育成熟，AsA 的含量也逐漸升高，儲藏過程中細胞衰老，APX 的底物AsA 減少，完熟期后APX活性隨之下降，可能與專一性的底物AsA 變化有關。

綜合來看，棗果實生長過程中3 種保護酶活性的變化趨勢與成熟衰老密切相關。SOD 是成熟衰老過程中的關鍵酶，其參與清除活性氧的第1 步反應。CAT 和APX 參與活性氧清除的第2 步反應，CAT 是生物體內重要的清除H2O2關鍵酶之一，APX 是清除葉綠體中H2O2的關鍵酶。SOD、CAT 和APX 這3 種保護酶協同清除氧自由基，促進棗果實的生長成熟。由此可推出，適當提高棗成熟期棗果實的3 種保護酶活性，可以延長棗果實的貯藏時間。