小麥-中間偃麥草代換系CH188 分子細胞學鑒定

羅小軍，喬麟軼，李 欣，郭慧娟，閻曉濤，張樹偉，常利芳，閆金龍，暢志堅，張曉軍

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院作物科學研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，山西省主要農作物種質創新與分子育種重點科技創新平臺，山西太原030031；3.山西省農業科學院谷子研究所，山西長治046011）

中間偃麥草（Thinopyrum intermedium，2n＝42）是禾本科多年生植物，是普通小麥近緣物種之一，它根系發達，耐寒性極強，免疫白粉、條銹、葉銹、稈銹等多種病害，并且有較強的耐鹽堿、耐旱和耐低溫性，再生性好、適應性廣等特性，是小麥遺傳改良中重要的三級基因源[1-3]。通過遠緣雜交技術將中間偃麥草中優良基因導入小麥基因組中，選育和創造出人類需要的種質資源，同時對小麥優質、高產、抗病、抗逆等遺傳改良將起到積極的促進作用[3]。孫善澄[4]采用有性雜交、連續回交和后代定向選擇的方法，利用小麥和中間偃麥草選育出了中1、中2、中3、中4、中5 等5 個農藝性狀優良的八倍體小偃麥新物種小麥-中間偃麥草部分雙二倍體，具有高抗條銹、葉銹、稈銹等優良性狀，其中，中4、中5 高抗小麥黃矮病。BAO 等[5]從普通小麥與中間偃麥草雜種后代中選育出了TE253 和TE257 等10 個TE系列，可能攜帶有不同的優良基因八倍體小偃麥。區別于親本，八倍體小偃麥表現出莖稈粗壯，穗長優于主栽品種，結實率高、穗粒數多等優良農藝性狀。培育小麥-中間偃麥草的雙二倍體及部分雙二倍體，并以這些雙二倍體為橋梁創制與小麥親緣關系更近的異附加系、異代換系和易位系等，是克服直接遠緣雜交困難、雜種不育和雜種后代瘋狂分離的有效手段。CHANG 等[6]利用普通小麥與中間偃麥草雜交獲得了TAI7044、TAI7045、TAI7047、TAI8335 等多個八倍體小偃麥，并用這些八倍體小偃麥作為橋梁親本，繼續與小麥進行雜交、回交，選育出了CHadd7001、CHadd7002，豐富了小麥的遺傳資源，也是中間偃麥草有用基因向小麥轉移的重要載體。

本研究以八倍體小偃麥TAI7047 作為母本與普通小麥雜交，回交育成的高代新品系CH188 進行農藝性狀、細胞學和分子標記綜合鑒定，確定其優良農藝性狀以及導入小麥基因組中的外源染色體，為后續鑒定染色體組成、抗病性、抗逆性，利用該小麥近緣種質資源提供重要信息。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

TAI7047、CH188 由山西省農業科學院作物科學研究所選育。TAI7047 由暢志堅等育成，源于普通小麥與中間偃麥草雜交后代的八倍體小偃麥新類型，TAI7047 的系譜為太原768/中間偃麥草//系76（64）。CH188 為普通小麥晉太170 與TAI7047 雜交，回交后選育的高代穩定品系。晉太170 為國審優質強筋小麥品種，由溫輝芹等[7]提供。中國春為分子標記的對照組。

1.2 試驗方法

1.2.1 農藝性狀調查 2018—2019 年將TAI7047、CH188、晉太170 和中間偃麥草在山西省農業科學院作物科學研究所創新基地日光溫室進行播種，每份種3 行，行長150 cm，行寬20 cm，每行20 粒，待材料成熟后進行田間農藝性狀的調查，從每份材料中抽取10 個單株，測量株高、穗長、每穗粒數、小穗數、千粒質量。

1.2.2 細胞學鑒定 根尖有絲分裂中期染色體制備參考文獻[8]。將10 株小麥-中間偃麥草異代換系CH188 材料，編號為1～10，每單株選取10 粒種子進行根尖細胞有絲分裂染色體中期數目的觀察，步驟如下：將5 粒種子放在蘸有水的濾紙上，在24 ℃下發根，等種子露白在4 ℃冰箱處理24 h 后置于24 ℃，發育到根尖長到1.0～1.5 cm，剪取1 cm長根尖，放在管壁噴有水的離心管中，并置于冰中，然后在0.9 MPa N2O 中處理2 h 后，把根尖放在90%冰醋酸（保證整個根尖浸沒其中）10 min 后，用蒸餾水洗滌3 次，吸水紙吸干根尖后，把根尖放在果膠酶和纖維素酶中，37 ℃酶解50～60 min，然后用70%酒精洗滌2 次，無水酒精洗滌1次，用解剖針把根尖搗碎，用移液槍混勻并吸取6.5 μL 于載玻片上方滴片，15 min 后在在相差顯微鏡鏡下觀察中期染色體分裂相，選擇細胞染色體完整且分散均勻的片子，記錄染色體的分散情況和數目。

1.2.3 分子標記 試驗材料剪根后栽種于花盆內，生長至三葉期時取其細嫩的葉片，利用CTAB 法[9]提取CH188、中間偃麥草、中國春總DNA。利用CTAB法提取總DNA。作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室根據中間偃麥草的Contig 序列，開發并篩選出了160 對中間偃麥草第六同源群特異STS 標記[10]，以中間偃麥草、中國春（中國春為對照）、CH188 為DNA 模板進行PCR 擴增，PCR 反應體系為15 μL，包括7.5 μL Taq PCR Mix 預混液（生工生物工程（上海）股份有限公司，Order NO.B639295），2 μL 模板DNA（50 ng/μL），1.8 μLPrimers（50 ng/μL，生工生物工程（上海）股份有限公司合成），3.7 μL ddH2O。PCR 擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55～65 ℃（不同Primers 略有不同）退火30 s，72 ℃延伸25 s，共34 個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳條件為恒壓220 V，50 min，硝酸銀染色后顯色照相并觀察結果。

2 結果與分析

2.1 小麥-中間偃麥草代換系CH188 的主要農藝性狀

由表1 可知，代換系CH188 株高為70.60 cm，穗長為14.60 cm，小穗數和穗粒數分別為28.30 個和55.4 粒，明顯優于親本晉太170 和TAI7047，經幾年的種植鑒定，CH188 農藝性狀比較穩定，較好的結合了親本的優良性狀。

表1 CH188、中間偃麥草、TAI7047、晉太170 主要農藝性狀比較

2.2 小麥-中間偃麥草代換系CH188 的細胞學鑒定

對小麥-中間偃麥草代換系CH188 材料進行根尖細胞有絲分裂染色體中期數目的觀察發現（圖1、表2），每1 株小麥-中間偃麥草代換系CH188材料根尖細胞染色體數目平均數接近42 條，預測CH188 染色體數目恒定，為小麥-中間偃麥草代換系，結合CH188 有穩定的農藝性狀，可以推測出CH188 屬于穩定材料。

表2 CH188 材料根尖有絲分裂中期染色體的分散情況與數目

2.3 小麥-中間偃麥草代換系CH188 的分子標記

中間偃麥草第6 同源群Contig 序列開發了160個STS 標記，位于G6-Chr1、G6-Chr2、G6-Chr3染色體的STS 標記分別為58、59、43 個。利用這些STS標記對中間偃麥草、中國春、CH188 進行PCR擴增，結果顯示（圖2），只有G6-Chr2 染色體的STS標記在中間偃麥草、CH188中均擴增出與目標片段一致的條帶，而在中國春中未擴增出該條帶。位于G6-Chr2 染色體STS標記擴增出特異性條帶的8個標記分別被命名為LD17-22、LD17-32、LD17-72、LD17-100、LD17-102、LD17-114、LD17-150、LD17-171。G6-Chr2 已被證實為中間偃麥草的6St 染色體[10]，結合田間農藝性狀、細胞學鑒定的結果，可以推測小麥-中間偃麥草代換系CH188 為小麥的一對染色體被中間偃麥草6St 染色體替代。

3 結論與討論

中間偃麥草是小麥外源基因利用較早，也較成功的物種之一，其染色體中優良基因一直是人們研究的重點。通過農藝性狀調查可知，CH188 表現出的莖稈粗壯，小穗數、每穗粒數、千粒質量都優于主栽品種，后續經幾年的種植鑒定，CH188 農藝性狀比較穩定，較好地結合了親本的優良性狀。結合100 份CH188 材料觀察根尖細胞有絲分裂中期數目為42 條，說明CH188 具有與普通小麥一致的染色體數目,細胞學穩定性強。

形態學具有鑒定操作簡單、直觀等優點，近年來，科研工作者把形態學方法作為鑒定和篩選新品種的首選方法[11-13]，但是形態學鑒定易受環境條件的影響，主觀判斷依賴于豐富的實踐經驗。分子標記技術的發展為其新種質材料的鑒定提供了新的發展方向，但迄今為止，中間偃麥草的全基因組數據尚未公布，其特異分子標記的篩選主要來自二倍體長穗偃麥草和擬鵝冠草[14-15]，以及部分利用PLUG 標記轉化的EST-STS 或SCAR 標記[16-17]，對鑒定材料中中間偃麥草染色體片段存在較大的局限性。本研究基于中間偃麥草第六同源群Contig 序列開發的160 個STS 標記，其中，位于G6-Chr1、G6-Chr2、G6-Chr3 染色體的STS 標記分別為58、59、43 個[10]，利用這些標記在中間偃麥草、中國春、CH188 中擴增，只有G6-Chr2 染色體的STS 標記在中間偃麥草、CH188 中均擴增出與目標片段一致的條帶，而在中國春中未擴增出該條帶。在相關文獻中也證實了G6-Chr2 為中間偃麥草的6St 染色體[8]，推測CH188是小麥中的一對染色體被中間偃麥草中的6St 替代的異代換系。小麥-中間偃麥草CH188 優良的農藝性狀可以作為小麥遺傳改良的優良資源加以利用，同時為下一步原位雜交技術驗證確定染色體構成，深度分析鑒定抗病性、抗逆性提供有利資源。