小麥材料CH1532 抗白粉病基因的染色體定位

孔佳茜，郭慧娟，喬麟軼，李 欣，賈舉慶，張樹偉，常利芳，閻曉濤，任永康，暢志堅，張曉軍

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院經濟作物研究所，山西汾陽032200；3.山西省農業科學院作物科學研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，山西省主要農作物種質創新與分子育種重點科技創新平臺，山西太原030031；4.山西農業大學農學院，山西太谷030801）

白粉病是普遍發生于小麥各個生育階段的一種世界性病害，可造成小麥減產及品質下降[1]。隨著矮稈品種的普遍種植及氮肥的大量使用，白粉病的危害日趨嚴重[2]。推廣品種中抗源狹窄、抗病基因單一的生產現狀，極易引起白粉菌生理小種的變異，使抗病品種喪失抗性，是小麥生產的重大安全隱患[3]。

迄今為止，國內外已從65 個位點上鑒定出85 個抗白粉病基因（Pm1～Pm65）[4-5]，但在生產上應用的非常有限，大多數抗病基因已隨著白粉菌的變異與擴展而失去抗性。因此，持續發掘與利用抗病資源，鑒定新的抗白粉病基因，并利用分子標記等技術進行抗白粉病基因聚合育種，增強現有品種的抗性，是小麥品種抗性改良的重大需求[6-7]。

CH1532 是通過遠緣雜交選育的一個小麥新品系，系譜為：中8701//TAP8430/冀麥26，其中，TAP8430 為來源于長穗偃麥草的八倍體小偃麥[8]，中8701 和冀麥26 為普通小麥。CH1532 成株期對白粉病具有優良抗性，苗期對多個小種表現為免疫或高抗，對小麥品種的抗病改良具有重要價值。

本試驗對CH1532 的白粉病抗性進行了遺傳分析，并利用SNP 芯片對其抗病基因進行了初步定位，旨在為研究與利用該抗源提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

抗病親本CH1532、感病親本臺長29 及其F1、F2、BC1和374 個F2∶3家系用于白粉病抗性鑒定。所用的白粉菌菌株為E09，來自中國農業科學院植物保護研究所，以幼苗活體繁殖的方法保存。感病對照為臺長29。

1.2 抗病鑒定

試驗材料的抗病鑒定采用苗期接種鑒定的方法。將用于苗期抗病鑒定的小麥材料播種于72 孔育苗盤中，每孔播5 粒種子，重復4 次。感病對照臺長29 播種于育苗盤四角及中心位置。種植約7 d后，小麥幼苗長至一葉一心，采用掃抹的方法人工接種白粉菌，且控制溫度為16～21 ℃，濕度65%左右，利于白粉菌生長。待對照臺長29 完全感病時，即可進行抗病調查。采用0～4 級分級標準[9]進行記錄，IT＝0，為免疫；IT＝0；為近免疫；IT＝1，為高抗；IT＝2，為中抗；IT＝3，為中感；IT＝4，為高感。

1.3 抗、感病池的構建及SNP 芯片掃描

取少量臺長29/CH1532 的F2群體單株及親本葉片置于2 mL 離心管中，液氮冷凍后在Scientz-48型高通量組織研磨器上將葉片打碎，利用CTAB 法[10]提取基因組DNA。根據F2及F2∶3家系抗病鑒定結果，采用分離群體分組分析法[11]分別選取25 株極抗（反應型為0 或0；）或極感（反應型為4）F2純合單株，每株取等量DNA 混合成抗病池和感病池，進行iSelect 90K SNP 芯片掃描。

1.4 SNP 結果分析及染色體定位

根據SNP 芯片掃描結果，篩選出抗親和感親間具有多態性的SNP 標記，進一步篩選出在抗、感病池間具有多態性的SNP 標記，去除信號缺失的標記和等位位點為雜合型SNP 的標記。對獲得的SNP標記進行分析，根據SNP 側翼序列，在中國春小麥全基因組序列（IWGSC RefSeq v2.0）中進行Blast N比對，獲得篩選到的多態性SNP 位點的染色體位置信息，并利用染色體畫圖軟件MapInspect 進行作圖，根據SNP 標記的富集區域確定抗病基因所在染色體位置。

2 結果與分析

2.1 抗病性遺傳分析

利用國內白粉病優勢菌株E09 對臺長29、CH1532 及其F1、BC1、F2及F2∶3家系進行接種鑒定，結果表明，CH1532 對E09 表現為免疫，臺長29 表現為高感，其正反交F1全部表現為免疫，與抗病親本CH1532 表現一致；與臺長29 回交的45 株BC1中有25 株表現為免疫或近免疫，20 株表現為高感，抗感比例符合1∶1（χ2＝0.556，P＝0.456），說明CH1532 中的抗白粉病基因為顯性核基因。374 個F2單株中有289 個單株表現為抗?。↖T＝0～2），85 個單株表現為感?。↖T＝3～4），抗感分離比例符合3∶1（χ2＝1.030，P＝0.310）（表1）。374 個F2∶3家系中，純合抗病的有96 個，抗、感分離的有190 個，純合感病的有88 個，抗感分離比例符合1∶2∶1（χ2＝0.439，P＝0.803）。因此推斷，CH1532 的白粉病抗性受1 對顯性核基因控制，暫命名為PmCH1532。

表1 臺長29/CH1532 組合對白粉菌株E09 的抗性反應

2.2 SNP 結果分析及抗病基因的染色體定位

SNP 芯片掃描結果表明，在iSelect 90K SNP 芯片的81 587 個標記位點中，有7 870 個SNP 在抗、感親本間具有多態性，占總標記數的9.65%；其中，有358 個SNP 在抗、感病池間具有多態性，占總標記數的0.44%；進一步去除信號缺失或等位位點為雜合型SNP 的標記，共獲得89 個多態性SNP 標記。

根據NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的中國春小麥全基因組序列（IWGSC RefSeq v2.0），對89 個多態性SNP 標記的側翼序列進行Blast N比對，獲得其所在染色體位置信息。從圖1 可以看出，多態性SNP 分布于小麥的14 條染色體上，其中，69 個位于小麥第2 同源群的3 條染色體上，占總數的77.5%，其余染色體上均為零星分布。而位于2A、2B、2D 染色體上的標記分別為14、11、44 個，分別占總數的15.7%、12.4%和49.4%。根據MapInspect 軟件進行染色體作圖，可以看出，SNP 標記在2A 和2B 染色體上分布較少，而在2D 染色體上多且分布集中（圖2）。因此，推測抗白粉病基因Pm－CH1532 位于2D 染色體長臂的末端。

3 結論與討論

單堿基多態性標記（Single nucleotide polymorphism，SNP），是隨著測序技術和基因芯片技術發展起來的第3 代分子標記[12]，具有密度高、位點豐富、遺傳穩定性好及分析自動化等優勢，已在生物、農學、醫學、進化等領域得到了廣泛應用[13-14]。目前，已開發出多款小麥SNP 芯片，包括9K、35K、55K、90K、660K 和820K 等，用于小麥連鎖圖譜構建、QTL 定位、遺傳變異檢測等研究[15-17]，但在小麥新基因發掘與定位上應用較少。吳秋紅等[18]利用90K SNP 芯片對河南省36 個小麥新品系進行了抗白粉病基因的規?；慷ㄎ?，證實了90K SNP 芯片在小麥基因分子標記定位方面的應用潛力。本研究采用其方法對小麥新品系CH1532 的抗白粉病基因進行了定位，結果表明，多態性SNP 富集于小麥第2 同源群的3 條染色體上，其中，位于Chr.2A 的有14 個，位于Chr.2B 的有11 個，位于Chr.2D 的有44 個。位于Chr.2D 的多態性SNP 顯著多于Chr.2A 和Chr.2B，且在染色體上的分布更為集中，主要富集于2D 染色體635.60～650.32 Mb 區間。根據臺長29/CH1532 遺傳群體對白粉菌株E09 反應型的分離規律，CH1532 中僅含有1 對抗白粉病基因，因此，推測其所含有的抗白粉病基因PmCH1532 位于2D 染色體長臂的末端。有部分多態性SNP 分布于Chr.2A 和Chr.2B 上，可能是因為小麥的A、B、D 基因組之間存在較高的同源性[19]，其序列也較為相似，導致該SNP 的識別序列存在于在2 個或3 個基因組中，這些SNP 側翼序列的Blast N 比對結果也證明了這一點。

小麥白粉病是一種小種?；驼婢『20]，由于白粉菌繁殖、適應能力強，變異快，小種復雜多樣，極易引起抗病基因失效[21]，因此，持續挖掘新的抗病基因是防治白粉病危害的一項長期任務。迄今，小麥上已定位了85 個抗白粉病基因，分布于除3D、4D、5A 之外的其他18 條染色體上[22]。2D 染色體上存在2 個抗白粉病基因Pm43[23]和Pm58[24]，而Pm43 與本研究定位的PmCH1532 都位于2D 染色體長臂上，Pm58 則位于2D 染色體短臂上。根據對PmCH1532 與Pm43 進行的分小種接種鑒定結果，13 個白粉菌株中，它們對5 個菌株的抗性反應明顯不同，因此，推測PmCH1532 是一個與Pm43 不同的新基因。本研究的下一步工作就是在SNP 芯片染色體定位的基礎上，開發SSR 或KASP 標記，對PmCH1532 進行精確定位，獲得該基因的精細圖譜和連鎖標記，以期為該基因在分子育種上的高效利用提供技術支撐。