胡蘿卜愈傷組織誘導條件篩選

劉真真，常雙峰，馮羽飛，王曉東，武 喆

（1.山西農業大學園藝學院，山西太谷030801；2.臨汾市農業環境監測站，山西臨汾041000）

胡蘿卜（Daucus carota L.）為傘形花科胡蘿卜屬2 年生草本植物[1]，其肉質根中含有豐富的胡蘿卜素，具有較高的營養價值和藥用價值。胡蘿卜是植物組織培養研究中的經典材料[2]，具有良好的組織培養和遺傳轉化基礎[3-4]，利用其不同組織進行愈傷組織誘導的研究有不少報道。陳豫等[5]以胡蘿卜肉質根切段為外植體進行了誘導愈傷組織研究，結果表明，2，4-D 與6-BA 配合使用誘導效果較好。曹樺等[6]對胡蘿卜嫩葉進行了組織培養研究，結果表明，1.0 mg/L2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA 是誘導松散型愈傷組織的最優激素配比。張唯等[7]以胡蘿卜2 個月幼苗的根、莖、葉為外植體進行研究發現，以莖為外植體誘導愈傷組織的質量最好，誘導率和分化率最高。汪洪等[8]研究了激素、外植體、光照、培養基類型等因素對胡蘿卜愈傷組織誘導的影響，結果表明，以下胚軸為外植體誘導愈傷組織較好，MS 培養基上添加1.0 mg/L 2，4-D 和0.5 mg/L KT 時愈傷組織的誘導頻率為100%，光照不影響愈傷組織誘導。莊飛云等[9]研究了胡蘿卜小孢子胚狀體愈傷組織的誘導條件，認為B5 培養基中添加NAA 和2，4-D 可形成小孢子的愈傷組織，低溫預處理對部分材料的小孢子愈傷組織的形成起一定作用。張婭等[10]研究不同外植體、培養基及激素配比對愈傷組織誘導的影響，結果顯示，B5 培養基優于MS 培養基，2 種培養基中下胚軸的出愈率均高于子葉。鄭回勇等[11]以胡蘿卜新黑田五寸人參為材料研究不同激素處理對愈傷組織生長的影響，結果顯示，以下胚軸誘導的愈傷組織質量和生長速度明顯優于子葉，2，4-D與其他激素共同使用時的愈傷誘導效果明顯好于單一激素，6-BA 的使用效果優于KT。由于組織培養的基因型依賴性較強，不同研究結果不盡相同。選擇合適的基因型是建立穩定高效再生體系的基礎[12]。在植物離體培養過程中，無論是外植體脫分化形成愈傷組織，還是愈傷組織經過器官發生途徑或胚狀體途徑形成再生植株，都是激素協同作用的結果[13]。因此，對于特定品種胡蘿卜的組織培養條件需要進一步探索。

本研究主要以17005 和19501 這2 個生產上主栽的胡蘿卜品種為試材，以子葉和下胚軸為外植體，研究種子滅菌條件、培養基類型及激素配比對愈傷組織誘導的影響，以期為胡蘿卜的高頻再生和建立高效遺傳轉化體系奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試品種 供試胡蘿卜品種為17005 和19501，由山西農業大學園藝學院提供。外植體為上述這2 個品種萌發8～9 d 的子葉及下胚軸切段。

1.1.2 供試培養基 種子萌發階段，采用1/2 MS培養基。愈傷組織誘導階段，采用添加不同質量濃度2，4-D 和6-BA 的MS、B5 培養基，培養基的組成如表1 所示。

表1 培養基類型與激素含量

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的獲得 將胡蘿卜種子放入蒸餾水中浸泡過夜，用無水乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗3 次，之后用不同的滅菌方式滅菌，即10%H2O2和20%H2O2溶液分別滅菌10、20 min，4%NaClO 分別滅菌10、15、20、30 min，再用無菌水沖洗3 次，用滅菌的濾紙吸干水分后，接種于不含激素的1/2 MS 固體培養基中，26 ℃黑暗條件下萌發8～9 d，誘導無菌苗，統計出苗率。

1.2.2 愈傷組織誘導 將萌發8～9 d 無菌苗的下胚軸和子葉切成0.5 cm 左右的小段，分別接種在添加不同激素的MS 和B5 培養基上誘導愈傷組織，置于26 ℃下暗培養，每次接種15 段子葉及20～25 段下胚軸，重復2 次，21～28 d 繼代一次。

1.3 數據處理

采用SAS 軟件對試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌方法對胡蘿卜無菌苗出苗的影響

由表2 可知，用20%H2O2溶液滅菌效果顯著好于10%H2O2和4%NaClO 溶液，且幼苗生長情況良好，未出現污染。其中，20%H2O2溶液滅菌20 min時2 個品種的出苗率最高，17005 品種為57.1%，19501 品種為52.6%，顯著高于其他處理。

表2 不同滅菌條件下2 個品種的出苗情況

2.2 基因型、外植體、培養基和激素對胡蘿卜愈傷組織形成的影響

表3 不同基因型、培養基和激素濃度對胡蘿卜子葉愈傷組織誘導的影響

由表3 可知，以子葉為外植體，17005 品種的M3 處理（MS＋0.5 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA）（圖1-a）的出愈率顯著高于M5 處理（B5＋1.0 mg/L 2，4-D），達93.3%，且出愈時間最短（21 d），愈傷組織生長速度快，但與其他處理間無顯著差異。19501品種的M3 處理（MS＋0.5 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA）（圖1-b）和M6 處理（B5＋0.5 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA）（圖1-c）的出愈率顯著高于其他處理，分別為80.0%和73.3%，但M3 處理愈傷組織出愈時間最短且生長速度最快；誘導效果最差的是M1 處理（MS＋0.5 mg/L 2，4-D）和M2 處理（MS＋1.0 mg/L 2，4-D），出愈率僅為13.3%和26.7%，顯著低于M4 和M5 處理。2 個品種以子葉為外植體在培養基中添加2，4-D 和6-BA 的出愈效果都比僅添加2，4-D 的好。

從表4 可以看出，以下胚軸為外植體，17005品種的M3 處理（MS＋0.5 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA）（圖1-d）和M6 處理（B5＋0.5 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA）的出愈率都達到100.0%，顯著高于M1，M4 和M5 處理，但M3 處理愈傷組織出愈時間（19 d）比M6 處理（22 d）少3 d，且愈傷組織生長速度快。19501 也是在M3 處理（圖1-e）和M6（圖1-f）處理出愈率最高，分別為92.0%和94.2%，與其他處理差異不顯著，但M3 出愈時間（18 d）比M6 出愈時間（19 d）少1 d。2 個品種以下胚軸為外植體在培養基中添加2，4-D 和6-BA 的出愈效果都比僅添加2，4-D 的好。

綜合表3 和表4，2 個品種的外植體均是以下胚軸誘導的愈傷組織出愈率最高，17005 的誘導率達到100.0%，19501 誘導率也都在90.0%以上。在MS 和B5 培養基中同時添加2，4-D 和6-BA 誘導愈傷組織的效果均較只添加2，4-D 的好。在最佳誘導條件下利用MS 和B5 培養基的誘導效果差異不顯著。

3 結論與討論

愈傷組織誘導過程中受多重因素影響，主要可以分為滅菌條件[14]、基因型[15]、外植體類型[7，16]、培養基類型[11]、激素配比等多個因素。

生長狀態良好的無菌苗的獲得與種子滅菌結果有直接關系，張唯等[7]選用75%乙醇＋84 滅菌液（主要成分為NaClO）與無菌水1∶1 配制的滅菌溶液進行滅菌；張婭等[10]使用75%乙醇＋0.1%升汞溶液滅菌；鄭回勇等[11]用75%酒精和2%的NaClO 溶液滅菌；ANNON 等[17]僅用70%的乙醇消毒30 s；楊艷梅等[18]用70%酒精和1%的AgNO3進行振蕩滅菌，能夠獲得生長旺盛的無菌苗。本研究利用以上滅菌方法均未達到良好的滅菌效果，因此對滅菌條件進行探索，試驗結果證明，無水乙醇＋20%H2O2溶液滅菌20 min 的效果最佳，無菌苗長勢較好。

愈傷組織誘導存在基因型和外植體的差異。本試驗以17005 及19501 種子萌發8～9 d 無菌苗的子葉和下胚軸為外植體，進行愈傷組織誘導。結果顯示，2 個基因型以下胚軸為外植體的誘導效果均高于子葉，誘導率都在92.0%以上，這與汪洪等[8]、張婭等[10]和鄭回勇等[11]的研究結果一致。

激素的配比[19]和培養基也是誘導愈傷組織的重要影響因素。生長素在愈傷組織誘導中起決定性作用，細胞分裂素則刺激細胞分裂，增加愈傷組織發生的數量。本試驗表明，MS 和B5 培養基在最佳處理組合（分別同時添加0.5 mg/L 2，4-D 和0.5 mg/L 6-BA）下對愈傷組織的誘導無顯著差異。汪洪等[8]研究認為，胡蘿卜七寸人參在同一激素條件下MS培養基誘導效果較B5 培養基好。高金秋等[20]研究表明，長城紅鑰對B5 和MS 培養基均表現適應，而開拓者僅在B5 培養條件下表現較好。說明胡蘿卜愈傷組織誘導的適宜培養基依賴于基因型。一定濃度的2，4-D 和6-BA 共同使用較單獨使用2，4-D對愈傷組織的誘導效果好，這與汪洪等[8]和鄭回勇等[11]的研究結果相同。