水稻OsBGAL1 基因的亞細胞定位分析

李軍玲，孫林靜，王曉靜，閆雙勇，張融雪，蘇京平，孫 玥

（天津市農作物研究所，天津市農作物遺傳育種重點實驗室，天津300384）

β-半乳糖殘基常見于糖脂（Monogalactosyldiacyl-glycerol，MGDG）[1]、蛋白多糖（Arabinogalactan proteins，AGPs）[2]和細胞壁多糖（木葡聚糖（Xyloglucans）和鼠李半乳糖醛酸聚糖I（Rhamnogalacturonan I，RGI））[3]等。β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，BGAL）（EC3.2.1.23）廣泛分布于植物、動物、微生物中，是一類糖苷水解酶（Glycoside hydrolases，GHs），能夠從β-D-半乳聚糖或寡糖支鏈非還原末端切除β-半乳糖殘基。植物BGALs 屬于GH35 基因家族，其通過對細胞壁的重塑參與多種植物生理過程，包括參與果實成熟軟化、花器官的發育、種子萌發和胚根伸長等。如AtBGAL6 基因T-DNA 插入失活后導致擬南芥種子黏液（一種特殊的次生細胞壁）不能釋放[4]，AtBGAL10 基因T-DNA 插入失活后導致果莢和萼片變短[5]。番茄TBG4、TBG6 基因[6-7]、草莓FaβGal4 基因[8]、柿子DkGAL1 基因[9]、桃子PpBGAL10、PpBGAL16 基因[10]都與果實軟化相關。

水稻基因組中含有15 個BGALs 基因，根據進化聚類分析可以分成a1（OsBGAL1-3、OsBGAL7）、a2（OsBGAL13）、a4（OsBGAL8）、a5（OsBGAL4）、b（OsBGAL5、OsBGAL12、OsBGAL14、OsBGAL15）、c1（OsBGAL10-11）、c2（OsBGAL6）、d（OsBGAL9）8 個亞家族，所有水稻BGALs 基因的生理功能都不清楚，15 個成員中只有OsBGAL1、OsBGAL2、OsBGAL13 被證明具有生化活性[11-12]。2007 年Mallika CHANTARANGSEE 等[11]從生長10 d 的水稻幼苗中分離得到OsBGAL1（Os03g0165400）和OsBGAL2（Os03g0165400）蛋白，其中，體外表達的OsBGAL1融合蛋白可以水解β-（1-3）-、β-（1-4）-、β-（1-6）-連接的半乳二糖和半乳三糖、p-硝基苯基β-D-半乳糖苷和p-硝基苯基β-D-巖藻糖苷；OsBGAL1在15～30 d 水稻幼苗的根、地上部和葉鞘中表達較高，但在花和未成熟的種子中表達量很低。

為了深入研究OsBGAL1 基因的生物學功能，本研究克隆獲得其ORF 序列，通過酶切連接成功構建pBWA（V）HS-OsBGAL1-GFP 亞細胞定位載體，轉化農桿菌，并利用農桿菌介導的煙草瞬時表達方法進行亞細胞定位觀察，以期為深入分析OsBGAL1基因可能參與的生物學過程提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的日本晴（Oryza sativa L.Japonica cv.Nipponbare）種子、本氏煙草（Nicotiana benthamiana）種子、大腸埃希氏桿菌DH5α、農桿菌菌株GV3101、植物表達載體pBWA（V）HS-GFP 均是由天津市農作物遺傳育種重點實驗室保存。

質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，高保真Taq 酶購自寶日醫生物技術（北京）有限公司（Code No.R010Q），反轉錄試劑盒購自寶日醫生物技術（北京）有限公司（Code No.6210A），內切酶Eco31I、Eco32I 購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，其他生化試劑購自索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 日本晴cDNA 的制備 采用Trizol 法提取日本晴生長10 d 幼苗的總RNA，利用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，反應體系如表1 所示，65 ℃，10 min；42 ℃，50 min；95 ℃，5 min。將制備好的cDNA 置于-20 ℃保存備用。

表1 反轉錄反應體系

1.2.2 亞細胞定位瞬時表達載體的構建 根據水稻OsBGAL1 基因在NCBI 數據庫中序列設計引物，以日本晴cDNA 為模板，PCR 擴增帶有Eco31I酶切位點的OsBGAL1 的ORF 全長（去除終止子）。PCR 引物為OsBGAL1（+）：cagtGGTCTCacaacatgggg agggggtgcctggc；OsBGAL1（-）：cgatGGTCTCatgcagcgg tagagcataccg。采用50 μL 體系進行PCR 反應，如表2 所示。PCR 反應程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸100 s，30 個循環；72 ℃延伸10 min。擴增完成后進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，對目的基因片段進行切膠回收并純化。將載體pBWA（V）HS-GFP 和純化的基因片段用Eco31I 進行酶切回收后，用T4 連接酶連接載體和基因片段；隨后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，PCR 篩選陽性克隆，提取質粒后進行酶切驗證，并測序分析；保存測序正確的菌種并命名為pBWA（V）HS-OsBGAL1-GFP。

表2 PCR 反應體系

1.2.3 pBWA（V）HS-OsBGAL1-GFP 在煙草葉片中瞬時表達和亞細胞定位 將質粒pBWA（V）HSOsBGAL1-GFP 電轉化農桿菌GV1301，30 ℃培養2 d；挑取鑒定正確菌斑，用液體LB 培養基（含卡那霉素（50 μg/mL）和利福平（25 μg/mL））培養至對數生長期；取菌液2 mL，4 000 r/min 離心5 min，棄上清液收集菌體；將收集的菌體用農桿菌懸浮液（10 mmol/L 的MES（pH 值5.7）、10 mmol/L MgCl2和120 μmol/L乙酰丁香酮）懸浮，調整菌液濃度OD600至0.7 左右；挑選生長30 d 左右狀況良好的煙草植株，用去針頭的1 mL 注射器從煙草葉片下表皮注射農桿菌懸浮液，做好相應標記，將注射完成的煙草植株弱光條件下培養2 d，剪取有標記的農桿菌注射的煙草葉片制成玻片，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 OsBGAL1 基因的克隆與亞細胞定位載體的構建

以日本晴cDNA 為模板，擴增OsBGAL1 基因到終止密碼子前的全長ORF 序列，全長2 523 bp。將目的片段連接到pBWA（V）HS-GFP 載體上，轉化大腸桿菌DH5α，PCR 鑒定陽性克隆質粒，并用Eco32I 酶切驗證后進行測序，測序結果表明（圖1），克隆序列正確，載體構建成功。

2.2 OsBGAL1 蛋白質的亞細胞定位

用打孔器將侵染2 d 的煙草葉片剪去，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察（圖2）。由圖2 可知，pBWA（V）HS-GFP 空載體對照的綠色熒光分布于細胞內各個組分，如細胞膜、細胞核、內質網等，OsBGAL1與pBWA（V）HS-GFP 表達載體融合后，綠色熒光信號主要分于細胞壁上或細胞膜上。

3 結論與討論

目前，已有試驗證明，BGALs 定位于細胞壁，與其參與細胞壁重塑功能一致。擬南芥AtBGAL1、AtBGAL2、AtBGAL5、AtBGAL6、AtBGAL8、AtBGAL12等被用不同的方法如免疫金標記、點雜交、GFP 融合蛋白、蛋白質組學等證明定位于細胞壁[4，13-15]；蘋果Mdβ-Gal1、Mdβ-Gal2、Mdβ-Gal5 這3 個基因的GFP 融合表達載體在洋蔥表皮細胞瞬時表達結果證明，3 個基因全部定位于細胞壁[16]。本研究利用GFP融合蛋白及煙草瞬時表達技術對水稻OsBGAL1 基因進行了亞細胞定位，激光共聚焦觀察結果表明，與空載相比，OsBGAL1 蛋白在細胞中的分布存在差異，與AtBGAL6 的煙草亞胞定位結果相似，主要定位于細胞壁，結合其生化活性，揭示其可能通過對細胞壁的重塑發揮重要生理功能。