谷子AMT 基因家族的鑒定及生物信息學分析

張 潔，葉 玲，郭永正，趙雄偉，楊致榮

（1.山西農(nóng)業(yè)大學文理學院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西太谷030801）

氮是植物生長、發(fā)育以及生產(chǎn)過程中所必需的大量營養(yǎng)元素之一。氮素的吸收利用對植物的生長發(fā)育具有重要的影響。然而氮素的利用效率較低，低水平的氮素利用率不僅造成生產(chǎn)成本的增加，還會造成環(huán)境污染，如土壤酸化、水體營養(yǎng)化等[1]。因此，充分挖掘作物自身潛力，提高作物氮素利用效率具有重要意義。

對于大多數(shù)植物來說，主要通過根系來吸收無機氮和有機氮來促進植物的生長，其中，硝態(tài)氮（NO3-）和銨態(tài)氮（NH4+）是植物根系吸收的主要形式[2]。植物對NH4+的吸收和轉(zhuǎn)運，主要由植物銨轉(zhuǎn)運蛋白通過與其偶聯(lián)的H+-ATPase 所提供的細胞質(zhì)膜內(nèi)外化學滲透勢梯度來介導[3]。目前在植物中的銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白分為AMT1 與AMT2 這2 個基因家族[4]。植物吸收銨態(tài)氮主要依賴高親和銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（High affinity transporter system，HATs）和低親和銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（Low affinity transporter system，LATs），其中大多數(shù)的AMT1 屬于HATs，能吸收微摩爾濃度的NH4+[5]。植物AMT 在單子葉和雙子葉植物的多種組織中均有表達，且不同的植物含有不同數(shù)目的AMT 基因。近年來，有關(guān)植物AMT基因的克隆在許多植物物種中得到鑒定，如擬南芥中含有6 個AMT 基因[6-8]，水稻中含有12 個AMT基因[9]，楊樹中含有14 個AMT 基因[10]，在番茄[11]、百脈根[12]、油菜[13]中也發(fā)現(xiàn)了AMT 基因的存在。影響AMT 基因表達的主要因素有外部銨態(tài)氮的有效性和植株體內(nèi)氮素營養(yǎng)狀況[14-15]。已有研究表明，AMT基因的表達受植物氮水平的調(diào)節(jié)。缺氮3 d 后，擬南芥根中AtAMT1；1 和AtAMT1；3 的表達明顯上調(diào)，長期缺氮后AtAMT1；2 和AtAMT2；1 基因表達也上升[16-17]。

谷子（Setaria italica）起源于我國，是禾本科作物，具有抗旱、耐貧瘠等特性，在我國北方地區(qū)廣泛種植[18]。由于谷子的基因組小，生育周期短，未來有望成為遺傳改良育種理想的模式作物[19]。且目前谷子xiaomi 的全基因組測序已完成，這為谷子的生物學研究提供了基礎(chǔ)。

本研究利用生物信息學數(shù)據(jù)庫和生物軟件對谷子AMT 基因的組成進行了預測，并對谷子AMT基因的基因結(jié)構(gòu)、啟動子、在染色體上的分布、保守序列以及系統(tǒng)進化進行了分析，為了解谷子AMT基因以及谷子中銨鹽吸收機制打下基礎(chǔ)，對提高谷子氮素利用效率具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 谷子AMT 基因家族的全基因組鑒定

為了鑒定谷子全基因組水平上的AMT 基因家族成員，本研究利用擬南芥AMT 蛋白的氨基酸序列（來源于https：//www.arabidopsis.org/），運用BlastP 程序以及HMMER 程序（E-value＜10e-5）在xiaomi 數(shù)據(jù)庫中搜索谷子AMT 基因家族成員。最后運用Pfam數(shù)據(jù)庫對搜索的谷子AMT 蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域鑒定，最終確定谷子AMT 基因家族成員。谷子全基因組的氨基酸序列、CDS 序列以及DNA 序列在http：//foxtail-millet.biocloud.net/home 網(wǎng)站獲得。

1.2 谷子AMT 蛋白基本理化性質(zhì)及染色體分布

為了研究谷子AMT 基因家族成員的理化性質(zhì)，本研究利用ExPASy 工具（https：//web.expasy.org/）的protparam 軟件分析AMT 蛋白的等電點、氨基酸數(shù)目、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)、相對分子質(zhì)量以及總平均親水性；利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析其二級結(jié)構(gòu)；運用在線軟件SignalP-5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）完成蛋白質(zhì)信號肽的預測。運用Mapinspect 軟件繪制染色體分布圖，谷子AMT 基因家族成員在染色體中的物理位置以及谷子9 條染色體的長度信息來自谷子數(shù)據(jù)庫（http：//foxtail-millet.biocloud.net/home）。

1.3 谷子AMT 基因亞細胞定位及跨膜結(jié)構(gòu)域分析

通過在線軟件PSORT（http：//psort1.hgc.jp/form.html）對谷子的AMT 基因的蛋白質(zhì)序列進行亞細胞定位；通過TMHHM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）來分析跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目。

1.4 谷子、水稻、擬南芥、狗尾草AMT 蛋白系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

為了研究谷子中AMT 基因與其他物種AMT基因間的進化關(guān)系，本研究運用谷子xiaomi、擬南芥（Arabidopsis thaliana）（來源于https：//www.arabidopsis.org/）、水稻（Oryza sativa L）（來源于https：//phytozome.jgi.doe.gov）、狗尾草（Setaria viridis）的AMT 氨基酸序列，利用MEGA7 中的鄰接（Neighbor-Joining）算法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap 設(shè)置為1 000，其他參數(shù)選擇默認值。

1.5 谷子AMT 基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

為了研究谷子AMT 基因結(jié)構(gòu)及保守基序，本研究在谷子數(shù)據(jù)庫（http：//foxtail-millet.biocloud.net/home）中提取xiaomi AMT 基因序列上游1 500 bp的堿基序列，之后利用在線軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）獲得谷子AMT 基因家族成員啟動子區(qū)的順式作用元件。并對原數(shù)據(jù)進行可視化分析，最后利用軟件TbTools 來繪制谷子的順式作用元件圖。通過在線軟件MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）分析谷子AMT 蛋白的motif 組成，最大保守序列鑒定數(shù)目設(shè)置為10。

1.6 谷子AMT 基因表達譜分析

為了構(gòu)建谷子AMT 基因在不同組織和不同時期表達譜，分析谷子AMT 基因的組織表達特異性，本研究從xiaomi 基因組網(wǎng)站（http：//foxtail-millet.biocloud.net/home）獲得不同組織的FPKM值。最后使用TbTools 軟件繪制基因表達熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子AMT 基因理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)分析

利用擬南芥AMT 基因的氨基酸序列運用HMMER 以及BlastP 程序共獲得9 個谷子AMT 基因，分別命名為Si1g19720.1、Si5g37060.1、Si9g09400.1、Si1g24430.1、Si9g02830.1、Si5g37070.1、Si7g17570.1、Si3g20620.1、Si5g39610.1。序列分析表明，它們的編碼長度為465～504 個氨基酸，基因編碼區(qū)長度為1 236～1 512 bp，等電點在6.24～8.82，大部分在7左右，有2 個基因的等電點大于8；脂溶系數(shù)表明，Si1g19720.1、Si5g37060.1、Si9g09400.1、Si5g37070.1以及Si3g20620.1 的脂溶系數(shù)均大于100，為親水性蛋白，其他4 個基因的脂溶系數(shù)均小于100，為疏水性脂溶蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)分析表明，9 個AMT 基因的不穩(wěn)定系數(shù)均小于40，為穩(wěn)定性蛋白。谷子中9 個AMT 基因分布于5 條染色體上，分別分布在1H、3H、5H、7H、9H 染色體上。其中，位于5 號染色體上的基因最多，為3 條，且3 個基因在染色體上的位置相對集中。其次是1 號和9 號染色體，分別含有2 個基因。其余2 條染色體各含有1 個基因（表1）。盡管大多數(shù)SiAMT 基因在xiaomi 染色體上間隔良好，但也有一些可能潛在的串聯(lián)重復序列，例如Si5g37070.1 和Si5g37060.1，位于同一染色體中，所在距離較近，為了驗證是否串聯(lián)，對其進行序列比對，結(jié)果如圖1 所示，其同源性為87%，說明2 個基因的蛋白質(zhì)序列高度同源。通過對谷子AMT基因家族進行亞細胞定位以及跨膜結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明，基因Si1g19720.1 與Si9g09400.1 定位在類囊體膜上，其他基因分布在質(zhì)膜上，基因Si1g24430.1含有10 個跨膜結(jié)構(gòu)域，其余基因含有11 個跨膜結(jié)構(gòu)域（表1），這與AMT 基因家族含有11 個跨膜結(jié)構(gòu)域相一致。

表1 谷子AMT 基因家族成員理化性質(zhì)

表2 谷子AMT 基因家族二級結(jié)構(gòu)占比 %

二級結(jié)構(gòu)分析表明，9 個谷子AMT 蛋白的二級結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、β-折疊、擴展鏈以及無規(guī)則卷曲4 種形式組成，在9 個AMT 蛋白中，α-螺旋占二級結(jié)構(gòu)的40%～46%，其次，無規(guī)則卷曲占27%～35%，擴展鏈、β-折疊所占比例較小（表2）。由于α-螺旋靠氫鍵維持穩(wěn)定，在鋅指結(jié)構(gòu)、亮氨酸拉鏈、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋等基序中都含有α-螺旋，故α-螺旋所占比例越高，越有利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定以及特殊構(gòu)象的形成。

2.2 谷子AMT 基因系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

為進一步分析不同物種間AMT 基因的親緣關(guān)系，基于9 個谷子AMT、12 個水稻AMT、6 個擬南芥AMT 和7 個狗尾草AMT 基因的氨基酸序列，利用MEGA 7.0 進行多重序列比對構(gòu)建了近鄰（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹。圖2 結(jié)果表明，谷子中的9 個AMT 基因分為4 個亞家族，其中，Si1g24430.1 與Si7g17570.1 為一個亞家族；基因Si9g09400.1 為第2 個亞家族；Si3g20620.1、Si5g37060.1、Si5g37070.1 這3 個基 因為第3 個亞家族；其余3 個基因為第4 個亞家族。基因Si5g39610.1 與Sevir.5G401300.1、Si1g19720.1 與Sevir.1G193600.1、Si9g02830.1 與Sevir.9G019200.1、Si3g20620.1 與Sevir.3G215200.1、Si9g09400.1 與Sevir.9G090300.1、Si1g24430.1 與Sevir.1G242300.1 的同源性較高。Si5g37060.1 與Os01g61510.1、Si5g37070.1與Os01g61550.1、Si7g17570.1 與Os04g43070.1 的同源性較高。9 個AMT 基因與擬南芥的同源性均較低。谷子與狗尾草具有高度同源性，這與谷子和狗尾草的進化有關(guān)；且谷子與水稻的同源性比谷子與擬南芥的同源性高，這與谷子、水稻同為禾本科單子葉植物，而擬南芥為雙子葉植物有關(guān)，這一觀察結(jié)果符合當前對植物進化史的理解。

2.3 AMT 基因家族保守基序motif 以及基因結(jié)構(gòu)分析

對谷子AMT 基因的基因結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，除Si7g17570.1 基因外，其余8 個基因均為斷裂基因，即外顯子被內(nèi)含子隔開，且每個基因的基因結(jié)構(gòu)存在一定的差異。結(jié)合谷子AMT 基因的同源性分析可知，基因結(jié)構(gòu)越相似，其同源性越高，反之，其同源性越低。在谷子AMT 基因家族的編碼區(qū)中，含有0～2 個內(nèi)含子，其中，Si1g24430.1、Si5g39610.1和Si9g09400.1 含有1 個內(nèi)含子，Si7g17570.1 沒有內(nèi)含子，其余5 個AMT 基因含有2 個內(nèi)含子，占總AMT 基因個數(shù)的55.6%。SiAMT 基因編碼的蛋白質(zhì)具有較高的保守性，谷子在進化過程中，編碼區(qū)沒有因AMT 基因結(jié)構(gòu)發(fā)生變化產(chǎn)生較大變異。因此，推測谷子AMT 基因結(jié)構(gòu)變化的主要原因在于內(nèi)含子上，而不在外顯子上（圖3）。

對谷子AMT 蛋白中的保守基序進行分析發(fā) 現(xiàn)，總共鑒定了10 個具有29～50 個殘基的保守基序。在這10 個基序中，基序1～10 存在于第二、第三、第四亞家族蛋白中，且每個基因motif 的排布順序相同以及位置相近；第一亞家族中只存在motif 2、motif 3、motif 4、motif 5、motif 9。這些結(jié)果表明，谷子AMT 基因家族成員的保守性較高，這些保守motif的存在保證了AMT 基因家族成員在轉(zhuǎn)運銨鹽中發(fā)揮穩(wěn)定的作用。

2.4 谷子AMT 基因家族啟動子順式作用元件分析

為進一步預測谷子AMT 基因家族可能潛在的功能，對谷子AMT 基因家族啟動子順式作用元件進行分析。結(jié)果顯示，Si1g24430.1、Si7g17570.1、Si5g39610.1、Si1g19720.1 這4 個AMT 基因家族共預測到了9 類順式作用元件（圖4），且每個基因均含有參與干旱誘導、生長素、水楊酸、茉莉酸乙酯等順式作用元件。其中，Si1g19720.1 含有參與晝夜節(jié)律調(diào)控的順式作用元件；Si1g24430.1 和Si5g39610.1基因含有光反應(yīng)相關(guān)的啟動子元件，說明這3 個基因可能與光強、光周期變化或光形態(tài)發(fā)生有關(guān)。

2.5 谷子AMT 基因的表達譜分析

為了分析AMT 基因家族的表達模式，本試驗利用xiaomi 在不同時期及不同組織中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對AMT 基因家族的表達結(jié)果進行分析，結(jié)果顯示，9 個谷子AMT 基因家族的表達模式呈現(xiàn)多樣化，且基因間的表達量存在一定的差異（圖5）。其中，Si7g17570.1、Si3g20620.1、Si9g02830.1 這3 個基因在不同發(fā)育期及不同組織中呈現(xiàn)出高表達模式。而Si5g37070.1、Si5g37060.1、Si9g09400.1 等3 個基因在不同的組織和不同時期間呈現(xiàn)出低表達模式，且差異不明顯。在灌漿期，基因Si9g02830.1、Si7g17570.1 在葉中的表達顯著高于其他基因；同時，基因Si7g17570.1 在抽穗期前、抽穗期后以及不同組織在灌漿期的表達均顯著高于其他基因。抽穗期是谷子由營養(yǎng)生長向生殖生長的過程，它對谷子的開花、結(jié)果有重要的影響，灌漿期是最終形成產(chǎn)量的時期。因此，Si9g02830.1、Si7g17570.1 對谷子的產(chǎn)量、開花結(jié)果可能有一定的影響，且其啟動子區(qū)域含有與低溫、干旱等相關(guān)的脅迫誘導元件，說明這2 個基因?qū)χ参锏纳L有重要的意義，有待于進一步的研究。

3 結(jié)論與討論

谷子（Setaria italica）起源于我國北方的黃河流域，其栽培歷史至今已有7 000 a，是我國北方主要的糧食作物之一[20]。氮素是植物生長發(fā)育過程中重要的營養(yǎng)元素之一，銨態(tài)氮是高等植物常見的氮源之一，根際中NH4+的吸收是通過植物中的銨轉(zhuǎn)運蛋白（AMT）發(fā)生的。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的銨態(tài)氮（20～200 μmol/L）能促進植物的生長，但過量的銨態(tài)氮則會抑制植物的生長甚至死亡。銨態(tài)氮不僅可以作為礦質(zhì)養(yǎng)分為植物提供營養(yǎng)，還對植物體內(nèi)的氮代謝途徑具有重要的作用[21]。目前，生物信息學手段是預測分析植物蛋白質(zhì)序列理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系等的主要手段[22-23]。本研究運用生物信息學的方法鑒定了谷子中有9 個AMT 基因與銨鹽的吸收和轉(zhuǎn)運相關(guān)。谷子中9 個AMT 基因的編碼長度為465～504 個氨基酸，這與大多數(shù)植物AMT氨基酸個數(shù)介于431～532 個的報道一致[24]。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是判斷蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的重要因素，其中，α-螺旋、β-折疊是蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)，具有穩(wěn)定性，而無規(guī)則卷曲為蛋白質(zhì)的無序結(jié)構(gòu)，為不穩(wěn)定性[25]。谷子AMT 蛋白家族成員中α-螺旋和β-折疊所占比例均大于50%，而無規(guī)則卷曲所占比例較低，為穩(wěn)定性蛋白，這與理化性質(zhì)中預測的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)結(jié)果相一致。由于谷子中9 個AMT基因的保守motif 所在的位置以及數(shù)量具有一定的相似性，且均具有很好的保守性，故保證了AMT 基因家族成員在轉(zhuǎn)運銨鹽中發(fā)揮穩(wěn)定的作用。但谷子中9 個AMT 基因含有不同數(shù)目的內(nèi)含子，且每個基因所含有的順式作用元件不同，由于結(jié)構(gòu)決定功能，故推測谷子中9 個AMT 蛋白在吸收和轉(zhuǎn)運銨方面發(fā)揮著不同的作用，且親緣關(guān)系越接近，基因的保守基序、外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)越相似，這與研究結(jié)果一致[20]。系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，谷子與狗尾草具有高度同源性，這與谷子和狗尾草的進化有關(guān)；且谷子與水稻的同源性比谷子與擬南芥的同源性高，這與谷子、水稻同為禾本科單子葉植物，而擬南芥為雙子葉植物有關(guān)。另外，Si1g24430.1 和Si7g17570.1 這2 個基因分布在同一支上，其他7 個基因分布在另一支上，因此，可推測Si1g24430.1 和Si7g17570.1 與其他成員的功能存在較大的差異，這與SiAMT 的基因結(jié)構(gòu)及保守性分析中的結(jié)果相一致。在AMT 基因家族啟動子順式作用元件預測到與光響應(yīng)、生長素、低溫、干旱等相關(guān)的順式作用元件。在表達譜分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SiAMT 基因具有明顯的組織表達特異性，其中，基因Si7g17570.1 在不同時期的表達量均高于其他基因，具有一定的研究意義。近年來，有關(guān)植物銨態(tài)氮的吸收以及轉(zhuǎn)運的研究已有了一定的突破。谷子AMT 基因的研究，對進一步研究谷子對氮素的響應(yīng)機制有一定的影響，可為深入了解氮處理下谷子對氮素吸收利用的作用機制打下基礎(chǔ)。