西瓜不同品種枯萎病抗性的胚根接種鑒定方法

李麗莉，何艷軍，姚依秀，范敏*，高杰

(1.浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021； 2.新疆農業大學 林學與園藝學院，新疆 烏魯木齊 830052)

西瓜(Citrulluslanatus)為葫蘆科西瓜屬一年生藤本植物，是重要的經濟作物，在我國的種植面積和產量均居世界第一位[1]?？菸∈怯杉怄哏牭稐U菌(Fusariumoxyporumf.sp.niveum)引起的一種世界性土傳病害[2]，病原菌可在土壤中存活多年并逐漸積累，一般在連作地區發病較為嚴重。西瓜枯萎病發病率一般在20%～40%左右，嚴重時高達80%，甚至絕產[3-5]。西瓜枯萎病病原菌主要從根部侵入，通過阻塞維管束和導管來影響植物的水分運輸，造成植株萎蔫；同時分泌毒素，干擾寄主代謝功能，并且積累大量的酮類化合物，使寄主導管處變為褐色甚至死亡[6]；植株在整個生育期都會發病；西瓜幼苗發病時頂端呈失水狀，子葉和葉片萎蔫下垂，莖蔓基部失水皺縮，嚴重時變為褐色并猝倒。目前防治西瓜枯萎病的方法有嫁接[7]、化學防治[8-9]等措施，其中利用抗病品種防治西瓜枯萎病是最為經濟有效的措施[10]。

西瓜抗病性鑒定、篩選、評價工作是抗病育種的重要環節。建立客觀的接種鑒定體系，對篩選西瓜枯萎病抗病種質資源具有重要意義。西瓜枯萎病抗性鑒定及評價的常用方法有土壤接種法[11]、孢子懸浮液浸根接種法[12]、灌根接種法[13]、蘸胚根法[14]。其中，土壤接種法發病率較輕且不均勻；灌根法發病率低且不穩定；蘸胚根法易操作但潛育期較長，一般為8～9 d；孢子懸浮液浸根接種法是目前西瓜枯萎病接種鑒定廣泛采用的一種方法，潛育期在4 d左右，而且發病率較高，在西瓜枯萎病材料的接種鑒定上取得顯著成效，但該法鑒定周期較長，易受到植株生長狀態及外部環境的影響，影響對品種抗性的客觀評價，資源評價成本較高，降低了抗性品種的選育效率。

本研究在傳統的孢子懸浮液浸根法的基礎上加以改良，采用西瓜專化型尖孢鐮刀桿菌生理小種2，對露白5 d后的西瓜幼苗的胚根進行接種，接種5 d后觀察10份西瓜材料植株的生長狀態，并統計不同品種的發病率和病情指數，根據病情指數對西瓜種質材料進行抗病性鑒定評價，并利用DAB染色對該方法的鑒定結果進行驗證。與常規的枯萎病接種體系相比，此接種鑒定方法簡單，易操作，縮短了接種時間，且發病快，節省時間和空間成本。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用病原菌為西瓜?；图怄哏牭稐U菌2號生理小種，由本實驗室保存。所用接種材料為浙江省農科院蔬菜所西瓜研究室搜集的10份西瓜種質材料，分別為Ford hook、PI288317、PI368509、PI536457、冬瓜皮、PI278038、PI279460、Sun sweet、廣二和慶久。分別將10份材料的種子去皮，在10%NaClO中消毒15 min，無菌水中潤洗3次，每次5 min，用濾紙吸去多余水分，將消毒后的種子置于透明塑料盒中，在塑料盒底部放入兩層濾紙，并加入無菌水使其完全濕潤，倒掉多余水分，置于溫度為25 ℃、濕度為90%、光周期為16 h/8 h的光照培養箱中培養，培養5 d，待植株兩片子葉完全展開轉綠時，準備進行枯萎病病菌的接種。

1.2 尖孢鐮刀桿菌的培養及孢子懸浮液的配置

液體PDA培養基配制。取馬鈴薯葡萄糖肉湯25 g，加入1 L蒸餾水，攪拌至完全溶解，校正pH為5.4。分裝至500 mL三角瓶中，每瓶200 mL，置于121 ℃高壓滅菌鍋滅菌15 min，冷卻后備用。

固體PDA培養基配制。稱取馬鈴薯葡萄糖瓊脂46 g，加入1 L蒸餾水，加熱攪拌至完全溶解，校正pH為6.0。置于121 ℃高壓滅菌鍋滅菌15 min，冷卻至45 ℃左右倒平板備用。

尖孢鐮刀桿菌培養。將-70 ℃冰箱保存的西瓜枯萎病2號生理小種轉到PDA固體培養基活化，菌絲生長較快，初期白色，隨后菌絲變為玫紅色，培養至菌絲長滿板時，在超凈工作臺上將菌絲轉移至200 mL PDA液體培養基中，置溫度28 ℃、轉速200 r·min-1的搖床中培養12 h，使其產生大量孢子，將含孢子的PDA培養基用2層無菌紗布過濾，除去多余的雜質，利用血球計數板在顯微鏡下將孢子懸浮液的濃度調整到1*107·mL-1，用于接種鑒定。

1.3 枯萎病接種

將生長5 d的西瓜幼苗的胚根完全浸沒在上述配置的枯萎病菌孢子懸浮液中，5 min后取出，用滅菌濾紙吸干根表多余菌液，再用無菌水將根洗干凈，放回塑料盒中，將塑料盒放回培養箱培養。5 d后調查發病情況。

1.4 病情嚴重度統計和病指計算方法

病情嚴重度分為4級。0級，植株未發病，長勢正常；1級，植株發病較輕，少量須根顏色變為淺褐色；2級，葉片輕度萎蔫，大部分須根顏色發褐；3級，葉片萎蔫，主根和須根顏色均發褐。具體如圖1所示。計算病情指數[15]。

圖1 病情嚴重度分級情況

1.5 抗性調查評價標準及數據統計分析

植株發病率是病害調查時抗性鑒定的重要指標。根據幼苗根部褐色及葉片萎蔫程度進行人工評價和分級?？剐苑旨壈磭H標準分成4個等級：高抗，病情指數<20；中抗，病情指數21～50；低抗，病情指數51～80；感病，病情指數81～100。利用Excel軟件對發病率、病情指數和抗性評價等級進行整理統計。

1.6 西瓜幼苗的DAB染色

聯苯胺染色法DAB(diaminobenzidine)是常用的抗病評價指標，可檢測病原菌誘導后H2O2的積累水平。植物被病原菌侵染后，自身防御系統啟動，初期會產生大量活性氧(ROS)，其主要成分為H2O2；在過氧化物酶作用下，DAB可與H2O2結合形成紅褐色聚合物。

DAB染液的配置。10 mM Tris-HCl 9 mL、3%(m/V) CoCl21 mL、DAB，顯色時加入H2O25～10 mL混勻后立即使用。具體操作方法為：將接種枯萎病菌5 d的西瓜幼苗整株浸入1 mg·mL-1DAB染液中，25 ℃及光照下放置2 h，然后轉至95%乙醇中煮沸15 min，對幼苗進行充分脫色，觀察植株各部位是否出現紅褐色，并進行觀察拍照、抗性評價。

2 結果與分析

2.1 西瓜枯萎病菌的生長狀態

由圖2可見，將西瓜尖孢鐮刀桿菌2號生理小種的病菌接種到PDA固體培養基中，培養10 d后，菌落顏色由中心至邊緣變為紫紅色。在顯微鏡下觀察發現，分生孢子為無色，單孢為卵圓或桿狀。

A—正面菌落形態；B—反面菌落形態；C—顯微鏡下孢子形態。圖2 西瓜枯萎病2號生理小種的菌落表型 及孢子形態

2.2 西瓜種質抗病性

采用浸根法對西瓜5 d苗齡的幼苗進行枯萎病菌接種，5 d后調查發病情況。結合病情指數對10份西瓜種質的枯萎病抗性進行評價。表1顯示，10份西瓜種質材料的抗性存在較大差異，發病率19.9%～98.5%，病情指數16.7～94.4。其中，對西瓜枯萎病2號生理小種表現高抗的材料為1份(Ford hook)，發病率19.9%，病情指數16.7；表現為中抗的材料有3份，包括PI288317、PI368509、PI536457，發病率29.1%～44.9%，病情指數38.9～41.7；表現為低抗的材料有4個，包括PI279460、PI278038、Sun sweet、冬瓜皮，發病率67.7%～79.2%，病情指數69.4～75.0；表現為感病的材料有2個，為廣二和慶久，發病率分別為96.3%和98.5%，病情指數分別是91.8和94.4。

2.3 西瓜幼苗的DAB染色

ROS迸發是植物應答病原菌的早期防衛反應之一。當病原菌入侵植物時，會引起ROS迸發，加速體內ROS的積累[16]。研究表明，ROS的代謝與植物的抗病性有關，即ROS參與了植物與病原物互作體系中的許多關鍵過程，包括抗菌作用[17]、細胞壁強化[18]、植保素合成[19]、抗病信號傳導[20]和過敏性細胞死亡[21]等。利用DAB染色并通過褐色沉積反應可檢測植物體內ROS的積累情況，在一定程度上反映品種的抗病性。本研究對接種5 d后的西瓜幼苗進行DAB染色，來驗證本研究鑒定方法的結果。結果發現，不同植株的褐色沉積程度與其枯萎病抗性呈負相關。由圖3可知，抗病材料Ford hook的植株褐色沉積最淺，感病材料廣二和慶久的植株褐色沉積最深。以上結果表明，西瓜品種對枯萎病的抗性越強，其DAB染色顏色越淺；反之，西瓜品種對枯萎病的抗性越弱，其DAB染色顏色越深。DAB染色的結果與胚根接種結合人工鑒定的結果相吻合，說明本研究建立的西瓜枯萎病抗性的胚根接種鑒定方法切實可行。

表1 幼苗接種西瓜枯萎病抗性鑒定結果

A～J為10份西瓜的編號。圖3 西瓜10份種質材料接種5 d后DAB染色情況

3 小結

為使育種工作者能夠快速準確的篩選到抗病材料，以便進行后續研究，枯萎病抗性鑒定是西瓜抗病育種的關鍵環節。本研究在傳統浸根法的基礎上加以改良，對10份西瓜種質材料進行胚根接種，鑒定出1個高抗種質(Ford hook)和3個中抗的西瓜種質(PI288317、PI368509、PI536457)，為選育抗病、優質的西瓜品種提供了材料基礎。