放大膠在SDS-PAGE電泳檢測小麥HMW-GSs中的應用

劉永安，黃業昌，潘彬榮，岳高紅，梅喜雪，許立奎*，張宗宸

(1.浙南作物育種重點實驗室，浙江 溫州 325006； 2.溫州市農業科學研究院，浙江 溫州 325006)

高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)是小麥籽粒中的貯藏蛋白，盡管其含量只占小麥籽粒蛋白質總含量的12%左右，但其對各種面食加工品質的影響卻很大。其中，HMW-GS對面包加工品質的影響最大，其貢獻率達70%左右[1-2]。

在普通六倍體小麥中，HMW-GS由分別位于1 A、1B和1D染色體長臂上的Glu-1A、Glu-1B和Glu-1D位點編碼，每一位點由編碼分子量較大的x亞基基因和分子量較小的y亞基基因構成[3-4]。由于個別HMW-GSs基因的沉默，在普通小麥中通常只有3～5個HMW-GSs基因表達，而不是理論上的6個[5-6]。HMW-GSs具有豐富的多態性。

SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)電泳是一種常用的檢測小麥不同品種HMW-GSs組成的方法，其原理簡單，易于初學者掌握。然而，這種方法容易將遷移率相近的不同HMW-GSs做出誤判，尤其是上樣量大的情況下，電泳條帶變寬，亞基之間的差異就更會被掩蓋，往往被誤認為是同一個蛋白亞基[7]。為了克服這一問題，本研究在傳統SDS-PAGE電泳系統的基礎上加入了放大膠，即該改良SDS-PAGE電泳系統包括濃縮膠、放大膠和分離膠，從而使電泳的分辨率得到明顯提升。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的材料為小麥品種中國春和寧春4號。其中，中國春的高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)組成為N、1Bx7+1By8、1Dx2+1Dy12，寧春4號的HMW-GS組成為1Ax1、1Bx17+1By18、1Dx5+1Dy10[7-8]。

1.2 方法

1.2.1 HMW-GS的提取

用干凈刀片切取1/3～1/2粒小麥種子，放入一個預先準確稱量質量(精度為0.001 g)的1.5 mL離心管中，再稱量其質量以計算樣品的質量；然后往離心管中放入1粒直徑為4.0 mm的鋼珠，于高通量組織研磨儀上1 500 r·min-1研磨3 min；按每mg加25 μL蛋白質提取液，含70 mmol·L-1Tris-HCl，2% (V/V)β-巰基乙醇，2% (m/V) SDS，20% (V/V)甘油， 0.005% (m/V) 溴酚蘭，于渦旋混勻器上充分混勻；沸水浴10 min，取出冷卻至室溫，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液上樣。

1.2.2 傳統SDS-PAGE電泳

本研究SDS-PAGE采用雙板夾芯式垂直電泳槽(北京六一 DYCZ-30C)和DYY-8C型電泳儀。濃縮膠的濃度為5%，分離膠的濃度為12.5%，兩者交聯度均為3.33%，當溴酚藍跑出凝膠后即停止電泳，考馬斯亮藍染色。

1.2.3 改良SDS-PAGE電泳

傳統SDS-PAGE電泳后經考馬斯亮藍染色，查看中國春和寧春4號HMW-GS分離情況，然后用直尺測量寧春4號1Ax1亞基在分離膠內的遷移距離，并據此計算放大膠的灌入量。改良SDS-PAGE電泳系統的濃縮膠濃度為5%，放大膠的濃度為12.5%，分離膠濃度為8%，三者交聯度均為3.33%，電泳時間跟傳統SDS-PAGE凝膠電泳相同，考馬斯亮藍染色。

2 結果與分析

2.1 傳統SDS-PAGE電泳結果

從圖1中A可以看出，中國春的1Dy12亞基和寧春4號的1Dy10亞基的遷移速率非常接近，尤其是泳道1中的1Dy12亞基與泳道2中的1Dy10亞基的遷移速率幾乎不能看出差異，這樣就很容易將兩者誤認為同一亞基。

1—中國春；2—寧春4號；3—中國春；4—寧春4號。圖1 傳統SDS-PAGE電泳(A)和改良SDS-PAGE電泳(B)結果

2.2 改良SDS-PAGE電泳結果

從圖1中B可以看出，中國春及寧春4號不同高分子量谷蛋白亞基間的距離被明顯拉大，不同泳道間亞基遷移速率的差異也被放大，能夠較輕松地將泳道1和泳道3中的1Dy12亞基與泳道2和泳道4中的1Dy10亞基區分開來。

3 小結與討論

傳統SDS-PAGE電泳一般采用的是不連續緩沖系統，該體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠組成。其中，濃縮膠的作用主要是堆積作用，進入分離膠后，由于聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質可以容易地通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快，大分子蛋白質則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質在電泳過程中就會根據其各自分子量的大小而被分離。

在改良SDS-PAGE電泳系統中，濃縮膠的濃度較小，孔徑較大，其作用跟傳統的不連續緩沖系統的作用一樣，主要是堆積作用。放大膠的濃度較

大，孔徑較小，對蛋白質樣品起到初步分離的效果。分離膠的濃度較放大膠低，孔徑較放大膠大，因而蛋白質分子在其中的遷移速度較放大膠快，當分子量較小的蛋白質分子從放大膠遷移到分離膠后，其遷移速率將加快，而分子量較大的蛋白質分子仍然以較慢的速度在放大膠中遷移，這樣不同分子量的HMW-GSs從放大膠遷移到分離膠后，它們之間的距離將被拉大，即起到放大的作用。

與傳統SDS-PAGE電泳系統相比，改良SDS-PAGE電泳系統增加了放大膠，灌膠過程相對復雜。不過，改良SDS-PAGE電泳通過放大膠的放大作用，可將不同HMW-GSs條帶間的距離明顯拉大，其分辨率得到顯著提高。目前，放大膠在SDS-PAGE電泳檢測小麥HMW-GSs方面還處于探索階段，如能對其進行完善，相信該技術將成為傳統SDS-PAGE電泳的一個重要補充。