單-雙酶法制備蘇麻餅粕多肽工藝的優(yōu)化

徐世濤，熊延敏，朱秋勁*，胡 穎，周國(guó)君，朱建榮

(1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州大學(xué) 貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品加工與貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025； 3.遵義醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 遵義 563000； 4.貴陽(yáng)三聯(lián)乳業(yè)有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550025)

蘇麻是唇形科紫蘇屬(PerillafrutescensL.)的1年生草本植物，是一種優(yōu)質(zhì)的藥食兩用油料資源。蘇麻餅粕是蘇麻籽榨油后的副產(chǎn)物，總蛋白含量達(dá)28%～45%[1-2]，脫除單寧和植酸的餅粕蛋白含量更高。餅粕中氨基酸含量豐富，含有包括人體必需8種氨基酸在內(nèi)的18種氨基酸，不僅芳香適口，且不含硫甙及其降解物，具有無(wú)毒無(wú)害、消化率高等特點(diǎn)，其有效蛋白水平高于菜籽粕，接近豆粕，是公認(rèn)的組成均衡，優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源之一[3-4]，是優(yōu)質(zhì)的植物多肽原料。而多肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的分子量低于10 kDa的小分子物質(zhì)，易被人體消化吸收，生物利用率高，安全性好；分子量小于3 kDa的還具有多種生物活性，如抗衰老、抗癌、抗疲勞、降三高、免疫調(diào)節(jié)和營(yíng)養(yǎng)保健等[10-11]。多肽種類繁多，功能性好，在食品工業(yè)中，多肽具有較好的酸、熱穩(wěn)定性及吸濕保濕效果，其水溶性及黏度隨濃度變化慢，是食品中良好的功能添加因子[12]，如應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)食品[13]，軍用食品，醫(yī)用、保健食品[14]，嬰幼兒配方食品等。其應(yīng)用價(jià)值高，前景廣闊，對(duì)于提高人們的生活質(zhì)量和健康水平有重要意義。

目前制備多肽的方法主要是酶降解法，利用蛋白酶催化蛋白質(zhì)生成氨基酸和多肽[15]。酶降解法具有操作簡(jiǎn)單、條件溫和、專一高效、提取物營(yíng)養(yǎng)特性好、穩(wěn)定性和安全性高等優(yōu)點(diǎn)，是較理想獲取多肽的方法?，F(xiàn)階段大豆多肽、菜籽粕多肽、芝麻多肽、核桃多肽和玉米多肽[16]等植物多肽的酶法提取已被大量研究和應(yīng)用。而關(guān)于蘇麻餅粕，目前僅有少量被用于面包和擠壓蛋白等產(chǎn)品[17]，主要被用作飼料和肥料，利用率低。蘇麻多肽具抗氧化[5, 18-19]、抗癌[20-21]和廣譜抗菌[22]等多種功能活性，是一種具有較大開發(fā)應(yīng)用價(jià)值的天然產(chǎn)物。但因蘇麻蛋白提取分離過程繁瑣、效率較低、成本高，且營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)未被充分利用，最終難以將蘇麻多肽大量制備并應(yīng)用于食品工業(yè)中。

為縮短蘇麻多肽的提取工藝，簡(jiǎn)化條件，提高提取效率，減少在制備蘇麻分離蛋白和濃縮蛋白過程中的營(yíng)養(yǎng)成分流失，試驗(yàn)選用植物來(lái)源的菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶，動(dòng)物來(lái)源的胃蛋白酶、胰蛋白酶和微生物來(lái)源的堿性蛋白酶和中性蛋白酶進(jìn)行研究，探究不同來(lái)源蛋白酶直接酶解蘇麻餅粕時(shí)不同因素對(duì)酶解程度的影響，通過正交試驗(yàn)分別優(yōu)化堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和雙酶法酶解蘇麻餅粕制備多肽的工藝條件，對(duì)比不同處理方式與酶解方法對(duì)多肽提取指數(shù)的影響，以期為蘇麻餅粕的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 超微粉碎后的脫脂蘇麻餅粕干粉，實(shí)驗(yàn)室自制；菠蘿蛋白酶(實(shí)測(cè)25 975 U/g)、堿性蛋白酶(實(shí)測(cè)48 349 U/g)、胰蛋白酶(實(shí)測(cè)37 790 U/g)、胃蛋白酶(實(shí)測(cè)29 526 U/g)、牛血清白蛋白，Sigma公司；木瓜蛋白酶(實(shí)測(cè)41 342 U/g)、中性蛋白酶(實(shí)測(cè)43 371 U/g)，如吉生物科技。

1.1.2 儀器與試劑 AR224CN型電子分析天平，美國(guó)OHAUS儀器有限公司；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇科析儀器有限公司；Seven2GoTMpH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；L5S紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；CTFD-12S冷凍干燥機(jī)，青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；SpectraMAX190酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；101-2A型烘箱，天津市泰斯特儀器有限公司；XLF-30C新型高速連續(xù)式超微粉碎機(jī)，廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；JKX-20S恒溫加熱消煮爐、JK98系列自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南緊密科學(xué)儀器儀表有限公司。三氯乙酸、氯化銨，國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司；無(wú)水乙醇、硼砂、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、五水硫酸銅等均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 蘇麻餅粕中單寧及植酸的脫除 為考察蘇麻餅粕中的單寧、植酸2種抗?fàn)I養(yǎng)因子對(duì)蛋白含量測(cè)定及對(duì)蘇麻多肽提取的影響，對(duì)比研究去除單寧前后的蘇麻餅粕，采用酸性乙醇-水溶劑法，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇在pH 4.0、溫度70℃、料液比1∶6的條件下，提取3次(每次45 min)。提取液在4 200 r/min下離心20 min，去上清液，干燥后即脫除蘇麻餅粕中的單寧和植酸[23]。

1.2.2 蘇麻餅粕中蛋白質(zhì)含量測(cè)定 根據(jù)GB 5009.5—2016食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定中自動(dòng)凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定分析[24]。

計(jì)算公式：

(1)

式中，X為蘇麻餅粕中蛋白質(zhì)的含量(g/100g)，V1為測(cè)定樣品消耗的鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積(mL)，V2為滴定空白組消耗的鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積(mL)，C為鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度(0.05 mol/L)，0.014 0為氮的毫摩爾質(zhì)量(g/mmol)，m為樣品質(zhì)量(g)，F(xiàn)為蛋白質(zhì)換算系數(shù)(6.25)。

1.2.3 蘇麻餅粕酶解液的制備 將蘇麻餅粕干粉按比例準(zhǔn)確稱取，于緩沖溶液中混合充分溶脹0.5 h左右，選用菠蘿蛋白酶(pH 7.0，55℃)、木瓜蛋白酶(pH 6.0～7.0，40～60℃)、中性蛋白酶(pH 7.0～7.8，35～50℃)、堿性蛋白酶(pH 8.5～10.5，40～60℃)、胰蛋白酶(pH 7.0～9.0，35～45℃)和胃蛋白酶(pH 1.0～3.0，35～45℃)6種不同來(lái)源的蛋白酶在其最適pH及溫度范圍內(nèi)對(duì)溶脹后的蘇麻餅粕進(jìn)行酶解，為保證酶與底物充分結(jié)合，每隔30 min攪拌1次，完成后將酶解液置于沸水中煮沸滅酶10 min，終止反應(yīng)，冷卻后8 000 r/min離心10 mim取上清液，并用適當(dāng)體積的緩沖溶液洗滌沉淀后，再次離心后合并上清液，記錄體積，測(cè)定上清液中可溶性氮的含量，沉淀蛋白后冷凍干燥得到蘇麻多肽。

1.2.4 蘇麻餅粕酶解液中多肽含量的測(cè)定 蘇麻餅粕酶解液中多肽含量采用TCA-NSI法和雙縮脲法[25]。

1) 三氯乙酸可溶性氮法。取蘇麻餅粕酶解液2.5 mL與等體積10%TCA溶液充分混勻后，室溫下靜置30 min，4 200 r/min離心20 min，上清液采用雙縮脲法測(cè)定可溶性氮含量[26]。

2) 雙縮脲法。準(zhǔn)確稱取1.5 g五水硫酸銅和6.0 g酒石酸鉀鈉蒸餾水溶解，攪拌下加入10%NaOH溶液300 mL，蒸餾水定容至l L制得雙縮脲試劑(出現(xiàn)黑色沉淀或雜質(zhì)需重新配制)，轉(zhuǎn)移到塑料瓶中(或內(nèi)壁涂有石蠟的瓶中)，即可長(zhǎng)期保存。

精確稱取牛血清蛋白(BSA)配制成濃度為0 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。分別取1 mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液于干燥潔凈的試管中，加入4 mL雙縮脲試劑，渦旋振蕩充分混勻后，室溫下顯色30 min，于540 nm下測(cè)定吸光值。以BSA蛋白濃度為橫坐標(biāo)，A540為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)樣測(cè)定散點(diǎn)圖，獲得標(biāo)準(zhǔn)液濃度與吸光度的回歸方程。

取10%TCA沉淀并離心后的上清液1 mL、加入雙縮脲試劑4 mL，混合均勻后在室溫下顯色30 min ，測(cè)定吸光度A540，對(duì)照回歸方程換算得到上清液中可溶性氮含量(mg/g)，通過以下公式計(jì)算多肽提取指數(shù)[27-29]。

(2)

式中，C為酶解上清液中可溶性氮濃度(mg/mL)，V為酶解上清液體積(mL)，N為原料中總氮含量(mg)。

1.2.5 6種蛋白酶單酶酶解的單因素試驗(yàn) 為確定各因素對(duì)酶解提取多肽的影響，以6種蛋白酶單獨(dú)酶解蘇麻餅粕。由于蛋白酶在最適pH值范圍內(nèi)變化對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響不大，故只對(duì)酶解體系中酶底比(A)、料液比(B)、酶解時(shí)間(C)和溫度(D)4個(gè)因素進(jìn)行探討。

1) 酶解時(shí)間。為考察酶解程度隨時(shí)間的變化情況，將蘇麻餅粕粉按照料液比為3%(w/v)分別加入蛋白酶對(duì)應(yīng)最適pH的緩沖液中，溶脹后，分別加入7%(w/w)各蛋白酶，在其最適溫度下，按表1的時(shí)間條件進(jìn)行酶解，測(cè)定各酶解液中可溶性氮含量。

2) 酶解溫度。為探究蛋白酶溫度對(duì)其酶解效果的影響，將蘇麻餅粕粉按照料液比為3%(w/v)分別加入蛋白酶對(duì)應(yīng)最適pH的緩沖液中，溶脹后分別加入7%(w/w)的蛋白酶，按表1中溫度條件和已確定的酶解時(shí)間進(jìn)行酶解。測(cè)定各酶解液中可溶性氮含量。

3) 料液比。將蘇麻餅粕粉按表1中料液比條件加入蛋白酶對(duì)應(yīng)最適pH的緩沖液中溶脹后，分別加入7%(w/w)各蛋白酶，按已確定時(shí)間和溫度條件酶解。測(cè)定各酶解液中可溶性氮含量。

4) 酶底比。將蘇麻餅粕粉分別按照確定的料液比加入到蛋白酶對(duì)應(yīng)最適pH的緩沖液中溶脹后，按表1中酶底比條件加入各蛋白酶，按已確定溫度條件和酶解時(shí)間進(jìn)行酶解。測(cè)定各酶解液中可溶性氮含量。

1.2.6 單酶酶解提取蘇麻餅粕多肽的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇綜合酶解效果較好的堿性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶按表2分別進(jìn)行4因素3水平正交優(yōu)化試驗(yàn)，確定3種單酶的最優(yōu)工藝。

表1 6種酶酶解蘇麻餅粕單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Single-factor experiment design for enzymatic hydrolysis of P. frutescens cake by six proteases

表2 單酶酶解蘇麻餅粕正交試驗(yàn)因素及水平(L934)Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment (L934) for enzymatic hydrolysis of P. frutescens cake by single protease

1.2.7 雙酶酶解餅粕組合方式的確定 根據(jù)單酶單因素和單酶正交優(yōu)化結(jié)果，考慮到酶反應(yīng)的專一性和單一酶作用范圍小等問題，選多肽提取指數(shù)較高且pH相近的堿性和胰蛋白酶進(jìn)行組合。組合方式有3種：

組合1：在50℃條件下，調(diào)節(jié)溶液料液比3%，pH為9.5，先加3%的堿性蛋白酶酶解3 h，滅酶離心；取沉淀調(diào)節(jié)溶液料液比3%，pH為8.0，再加3%的胰蛋白酶,酶解3 h，滅酶離心，合并2次上清液，記錄體積并測(cè)定可溶性氮濃度。

組合2：在50℃條件下，調(diào)節(jié)溶液料液比3%，pH為8.0，先加3%的胰蛋白酶酶解3 h，滅酶離心，取沉淀調(diào)節(jié)溶液料液比3%，pH為9.5，再加3%的堿性蛋白酶，酶解3 h，滅酶離心，合并2次上清液，記錄體積并測(cè)定可溶性氮濃度。

組合3：用pH為8.5的緩沖溶液按料液比3%將蘇麻餅粕粉充分溶脹，在50℃條件下，同時(shí)加入3%的堿性蛋白酶和3%胰蛋白酶，共同酶解6 h后滅酶離心，取上清液，記錄體積并測(cè)定可溶性氮濃度。

1.2.8 雙酶酶解提取蘇麻餅粕多肽正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單酶單因素試驗(yàn)及雙酶組合方式試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶底比(A)、料液比(B)、酶解時(shí)間(C)和溫度(D)4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，其因素水平見表3。

表3 雙酶酶解蘇麻餅粕正交試驗(yàn)因素及水平(L934)Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment (L934) for enzymatic hydrolysis of P. frutescens cake by single-double proteases

1.2.9 蘇麻餅粕粉不同前處理及不同酶解方式對(duì)比分析 先按照已確定的雙酶酶解的最優(yōu)條件，酶解除去單寧和植酸前后的蘇麻餅粕，比較各酶解液可溶性氮含量差異。再進(jìn)一步采用單-雙酶的最優(yōu)條件酶解提取蘇麻多肽，比較單-雙酶酶解液中可溶性氮含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇麻餅粕的總蛋白質(zhì)含量

經(jīng)測(cè)定，去除單寧和植酸前的蘇麻餅粕蛋白質(zhì)含量為(41.21±0.087)%，脫除后的蘇麻餅粕蛋白質(zhì)含量達(dá)(50.84±0.618)%，顯著高于脫除前的含量(P<0.05)，因?yàn)槊摮龁螌?、植酸等雜質(zhì)提高了蘇麻餅粕中蛋白質(zhì)的占比，同時(shí)更容易將蛋白從紫蘇粕中提出。

2.2 不同因素對(duì)酶解蘇麻餅粕提取蘇麻多肽的影響

2.2.1 酶解時(shí)間 從圖1可知，酶解液中的可溶性氮含量隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升后趨于平緩的微弱下降趨勢(shì)。相同酶解時(shí)間下，堿性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解上清液中可溶性氮含量顯著高于中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶(P<0.05)。堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶在酶解4 h的酶解程度達(dá)最大，而木瓜和菠蘿蛋白酶在酶解4 h時(shí)基本平穩(wěn)，6 h時(shí)達(dá)最大。因此，選擇4 h為堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶的酶解時(shí)間，6 h為木瓜和菠蘿蛋白酶的酶解時(shí)間。

2.2.2 酶解溫度 從表4可知，同種酶的酶解體系中可溶性氮含量隨著溫度的升高逐漸增加，但當(dāng)溫度較高時(shí)，可溶性氮含量降低。在溫度在50℃時(shí)，堿性蛋白酶酶解體系中可溶性氮含量最高，為(159.49±3.64) mg/g，顯著高于其他蛋白酶(P<0.05)。而在木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶最適溫度下對(duì)蘇麻餅粕的酶解程度總體較低。試驗(yàn)表明，堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的酶解溫度分別為50℃、45℃、45℃、45℃、60℃和55℃。

表4 不同溫度6種酶酶解蘇麻餅粕的可溶性氮含量Table 4 Soluble nitrogen content of P. frutescens cake hydrolyzed by six proteases at different temperature mg/g

注：表中—為無(wú)數(shù)據(jù)。同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
Note: — means no data. Different lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP<0.05 level.

2.2.3 料液比 從圖2可知，隨料液比增大，不同蛋白酶酶解液中可溶性氮含量呈先升高后趨于平緩的微弱下降趨勢(shì)。料液比為3%時(shí)，胰蛋白酶解程度達(dá)最大；料液比為5%時(shí)，堿性蛋白酶酶解程度達(dá)最大，且顯著高于其他5種酶(P<0.05)，胃蛋白酶次之；料液比為7%時(shí)，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及菠蘿蛋白酶酶解程度均達(dá)最大。表明，胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的料液比分別為3%、5%、5%、7%、7%和7%。

圖2不同料液比6種酶酶解蘇麻餅粕的可溶性氮含量
Fig.2 Soluble nitrogen content ofP.frutescenscake hydrolyzed by six proteases under different solid/liquid ratio

2.2.4 酶底比 由圖3可知，6種酶的酶解液中可溶性氮含量隨著酶用量增加呈先增加后趨于平緩趨勢(shì)。其中堿性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶解程度顯著高于其余蛋白酶(P<0.05)。酶底比為3%、5%、7%、9%、9%和9%時(shí)，堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的酶解度分別達(dá)最高，因此堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的酶底比分別為3%、5%、7%、9%、9%和9%。

圖3不同酶底比6種酶酶解蘇麻餅粕的可溶性氮含量
Fig.3 Soluble nitrogen content ofP.frutescenscake hydrolyzed by six proteases under different enzyme/substrate ratio

2.3 單酶酶解的最佳工藝

從表5～6可知，堿性蛋白酶酶解時(shí)，各因素對(duì)酶解蘇麻餅粕的可溶性氮含量的影響極顯著，各因素影響依次為B>A>D>C，即料液比>酶底比>溫度>時(shí)間，最優(yōu)組合為A3B1C3D2。胃蛋白酶酶解時(shí)，各因素對(duì)酶解上清液中可溶性氮含量影響極顯著，依次為B>C>A>D，即料液比>時(shí)間>酶底比>溫度，最優(yōu)組合為A2B1C3D2。堿性和胃蛋白酶最優(yōu)工藝為料液比3%，酶底比5%，50℃酶解6 h。胰蛋白酶酶解時(shí)，除酶解時(shí)間外，其余三因素對(duì)酶解上清液中可溶性氮含量影響極顯著，各因素影響依次為B>C>A>D，即料液比>時(shí)間>酶底比>溫度，最優(yōu)組合為A2B1C3D2，即料液比為3%，酶底比為7%，50℃酶解6 h。

表5 單酶酶解蘇麻餅粕的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Result of orthogonal experiment of P. frutescens cake hydrolyzed by single protease

注：alc(Alcalase)為堿性蛋白酶；tp (Trypsin)為胰蛋白酶；pp ( Pepsin)為胃蛋白酶，下同。
Note: alc，Alcalase; tp，Trypsin; pp，Pepsin; The same below.

表6 單酶酶解蘇麻餅粕正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal test results for hydrolysis of P. frutescens cake by single enzyme

注： *和**分別表示差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)。
Note: * and ** indicate significance of difference atP<0.05 andP<0.01 level respectively.

2.4 雙酶酶解的最佳組合

根據(jù)雙酶組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得出組合2的酶解上清液中可溶性氮含量為(205.43±3.56)mg/g，顯著高于(P<0.05)組合1〔(176.93±8.95)mg/g〕和組合3〔(174.60±3.86 )mg/g〕?？赡苁菈A性蛋白酶分解蛋白分子中的肽鍵，效果優(yōu)于胰蛋白酶；而底物蘇麻餅粕經(jīng)胰蛋白酶先酶解斷裂賴氨酸或精氨酸的羧基后，堿性蛋白酶進(jìn)一步充分地酶解成為小分子的氨基酸或肽。而組合3中2種酶同時(shí)添加酶解，可能存在一定的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，但隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，堿性蛋白酶充分酶解后可達(dá)到組合1的效果。故雙酶酶解的最佳組合為先加胰蛋白酶再加堿性蛋白酶酶解。

2.5 雙酶酶解的最佳提取工藝

對(duì)表7雙酶酶解蘇麻餅粕正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析可知，雙酶法酶解時(shí)，溫度(F為6.334)和料液比(F為1481.07)對(duì)酶解蘇麻餅粕的可溶性氮含量影響極顯著，時(shí)間(F為5.273)對(duì)其影響顯著，而酶底比(F為0.484)對(duì)其影響不顯著。各因素的影響依次為B>D>C>A，即料液比>時(shí)間>溫度>酶底比，其最優(yōu)組合為A3B3C2D3。即料液比5%，酶底比7%，55℃酶解時(shí)間6 h。

表7 雙酶酶解蘇麻餅粕的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Result of orthogonal experiment of P. frutescens cake hydrolyzed by double proteases

2.6 不同前處理和酶解方式酶解蘇麻餅粕的可溶性氮含量及多肽提取指數(shù)

從圖4可知，雙酶法最優(yōu)條件酶解去除單寧和植酸前后的蘇麻餅粕酶解液中的可溶性氮含量間差異不顯著(P>0.05)；故可使用雙酶法直接酶解蘇麻餅粕提取蘇麻多肽。對(duì)比單-雙酶最優(yōu)工藝酶解蘇麻餅粕發(fā)現(xiàn)，雙酶酶解效果顯著優(yōu)于單酶酶解(P<0.05)，相比堿性蛋白酶〔(202.12±3.76 )mg/g〕、胰蛋白酶[(197.74±3.26 )mg/g]和胃蛋白酶〔(182.22±3.83)mg/g〕酶解液中可溶性氮含量分別提高7.8%、10.2%和19.6%。雙酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶酶解蘇麻餅粕的多肽提取指數(shù)分別為(52.88±0.39)%、(49.05±0.91)%和(47.98±0.36)%。

圖4不同前處理及不同酶解方式酶解蘇麻餅粕的可溶性氮含量及多肽提取指數(shù)
Fig.4 Soluble nitrogen content and polypeptide extraction index ofP.frutescenscake hydrolyzed by different pre-treatment and different hydrolysis patterns

3 結(jié)論與討論

為提高蘇麻籽榨油后的副產(chǎn)品的利用率，試驗(yàn)以蘇麻餅粕為原料，采用酶法直接酶解蘇麻餅粕粉提取蘇麻餅粕多肽，分析酶解過程中各因素影響情況，優(yōu)化不同單酶及雙酶法提取蘇麻水解肽工藝，并比較蘇麻餅粕粉不同前處理及單雙酶提取效果。研究結(jié)果表明，蛋白酶直接酶解蘇麻餅粕提取蘇麻餅粕多肽有良好的提取效果；堿性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶單獨(dú)酶解的最佳工藝是料液比均為3%，酶底比分別是5%、7%和5%，50℃酶解6 h，該條件下，多肽提取指數(shù)分別為(49.05±0.91)%、(47.98±0.36)%和(44.22±0.87)%。雙酶法酶解的最佳工藝為料液比5%，55℃條件下，先加3.5%的胰蛋白酶在pH 8.0條件下酶解3 h，調(diào)節(jié)pH為9.5后再利用3.5%的堿性蛋白酶再酶解3 h，多肽提取指數(shù)達(dá)(52.88±0.39)%。

為探明蛋白酶的種類、酶解時(shí)間、溫度、酶底比和料液比等因素對(duì)直接酶解蘇麻餅粕粉提取餅粕多肽的影響。通過對(duì)比6種不同來(lái)源蛋白酶對(duì)蘇麻餅粕多肽提取的影響發(fā)現(xiàn)，在其最適溫度和pH條件下，6種蛋白酶對(duì)蘇麻餅粕的酶解程度依次為堿性蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶>中性蛋白酶>菠蘿蛋白酶>木瓜蛋白酶。這與胡磊等[18，23,30]利用堿性蛋白酶提取多肽的結(jié)果一致，堿性蛋白酶更有利于蛋白多肽的提取。蛋白酶在酶解的過程中，酶解初期酶切位點(diǎn)較多，酶解液中氮含量升高較快，在一定的水解時(shí)間內(nèi)，餅粕中的蛋白質(zhì)得到充分的水解，并以多肽的形式存在；而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶切位點(diǎn)逐漸減少，酶解速率減慢，這與劉倩霞等[31]的研究結(jié)果一致；隨酶解時(shí)間的不同，酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及肽鏈長(zhǎng)短也存在差異，過長(zhǎng)的酶解時(shí)間會(huì)導(dǎo)致肽段進(jìn)一步酶解成短肽或氨基酸[32-33，故酶解液中的可溶性氮含量隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)呈緩慢下降趨勢(shì)。在相同的酶解時(shí)間內(nèi)，酶解溫度對(duì)酶活性有一定影響，在一定范圍內(nèi)，溫度升高有利于酶催化性能的提升，酶催化反應(yīng)速率增加，酶解能力增強(qiáng)，可溶性氮含量升高；而溫度過高后，酶活力受到影響，影響酶解速率。在一定的酶解溫度和時(shí)間內(nèi)，隨酶添加量增加，酶與蛋白質(zhì)分子肽鍵的接觸幾率增大，在一定時(shí)間內(nèi)被水解的肽鍵數(shù)增加；但當(dāng)酶用量超過一定的值后，底物與酶的接觸幾乎達(dá)到飽和狀態(tài)[34]，可溶性氮含量增加的趨勢(shì)減小。在其他條件都一定的情況下，當(dāng)體系中料液比較低時(shí)，酶與底物相結(jié)合的幾率??；隨料液比增加，酶與底物能夠充分結(jié)合，可溶性氮含量增加較快。但隨著料液比持續(xù)增大，由于空間位阻、流動(dòng)性減弱和第2個(gè)底物分子結(jié)合在酶的非活性部位等作用，影響酶與蘇麻餅粕中蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致酶的催化效率下降[35]，表現(xiàn)為底物抑制作用[36]。因此在利用蛋白酶直接酶解蘇麻餅粕制備蘇麻餅粕多肽時(shí)，酶解時(shí)間、酶解溫度、料液比和酶底比的調(diào)整選擇尤為關(guān)鍵。

在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，直接利用蛋白酶酶解蘇麻餅粕批量提取蘇麻多肽，簡(jiǎn)化了提取蛋白后酶解制備蛋白肽工藝，不僅可降低成本，還可充分保留餅粕中其他活性物質(zhì)，利于發(fā)揮蘇麻餅粕更大價(jià)值。且雙酶酶解效果顯著優(yōu)于單酶，這為將來(lái)更好的開發(fā)應(yīng)用功能性蘇麻餅粕多肽提供了新的途徑，為進(jìn)一步開發(fā)利用蘇麻餅粕的價(jià)值，提高其附加值，并為蘇麻餅粕肽產(chǎn)品的研發(fā)與生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持和參考。但研究提取得蘇麻餅粕多肽僅從大批量提取和應(yīng)用考慮，未對(duì)其進(jìn)行分離純化，如若進(jìn)行精細(xì)化研究或生產(chǎn)應(yīng)用，還需進(jìn)一步分離純化應(yīng)用；另蘇麻多肽產(chǎn)品的研發(fā)生產(chǎn)和功能表征等，還需進(jìn)一步深入研究。