綠蘿葉腐病病原菌16S rDNA序列的克隆與分析

鄔張穎，徐凡舒，鐘依妮，馬佳瑩，朱 欣，張慧娟，蔣 明

(臺州學院 生命科學學院，浙江 椒江 318000)

綠蘿(Epipremnumaureum)是天南星科(Araceae)常綠藤本植物，株型美觀、葉色、葉型多樣，且易繁殖，是一種深受人們喜愛的室內觀賞植物。綠蘿以葉色碧綠的種類最為常見，此外還有豐富的變異類型，有葉片卷曲綠中帶白的“N’Joy”綠蘿(E.aureum’N’Joy’)、葉片呈淺黃色的“金藤”綠蘿(E.aureum’All Gold’)及葉片具白色斑塊的“瑪伯皇后”綠蘿(E.aureum’ Marble Queen’)等。綠蘿除有較高的觀賞價值外，還能吸收有害氣體和凈化水體，在環境保護中起著重要作用。與其他植物類似，綠蘿在栽培過程中易受多種病害的侵擾，常見的病害有褐斑病、炭疽病、根腐病、葉斑病和葉腐病等，由真菌或細菌引起，發病時葉片、莖或根部受害，導致植株生長速度減慢和觀賞價值下降，嚴重時甚至整株死亡[4-5]。葉腐病(Leaf rot)是一種能引起葉片、葉柄腐爛的病害，在高溫高濕環境下易發生，嚴重時整個受害組織呈褐色并壞死，影響綠蘿的觀賞價值。目前，有關綠蘿葉腐病相關的研究鮮見報道。

果膠桿菌屬(Pectobacterium)細菌隸屬于溶果膠菌科(Pectobacteriaceae)，該科由果膠桿菌屬、布倫納氏菌屬(Brenneria)、菊歐文氏菌屬(Dickeya)和索達里氏菌屬(Sodalis)等屬組成，大部分種類為植物的病原菌。果膠桿菌屬是一類腐生細菌，是多種作物和觀賞植物的致病菌，可引起軟腐病、黑脛病和莖基腐病等病害，每年造成的經濟損失巨大。常見的果膠桿菌屬病原細菌有胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(P.carotovorumsubsp.brasilliensis)、山葵果膠桿菌(P.wasabiae)、胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種(P.carotovorumsubsp.carotovorum)和黑腐果膠桿菌(P.atrosepticum)等[7-9]。臺州學院生命科學學院分子生物學實驗室于前期從綠蘿葉片中分離到葉腐病的病原菌菌株LR12，經形態學、生理生化和離體接種鑒定后，初步判斷為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種，研究以其為材料，在克隆16S rDNA的基礎上，進行序列分析和系統發育分析，以期為后續開展該病原細菌的分子鑒定和應用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種菌株LR12，分離自綠蘿葉腐病病葉，經鑒定后保藏于臺州學院生命科學學院分子生物學實驗室。該菌為革蘭氏陰性菌，菌體短桿狀，具鞭毛；菌落表面光滑、圓形，呈乳白色。

DNA提取試劑盒和PCR產物回收試劑盒均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司(鼎國生物)。

序列比較所用16S序列下載自NCBI(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov)，分別是P.polaris(NR_159084)、P.carotovorumsubsp.odoriferum(JF926728)、胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(JF926720)、鼻硬肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniaesubsp.rhinoscleromatis)(NR_114507)、產氣克雷伯氏菌(K.aerogenes)(MN326677)、 菊歐文氏桿菌香蕉致病變種(D.paradisiaca)(AF520710)、水稻基腐病菌(D.zeae)(NR_041923)、花葉萬年青狄克氏菌(D.dieffenbachiae)(AF520712)、花葉萬年青狄克氏菌亞種(D.dadantiisubsp.dieffenbachiae)(NR_041924)、水生沙雷氏菌(Serratiaaquatilis)(NR_147771)、S.glossinae(FJ790328)、居泉沙雷氏菌(S.fonticola)(NR_116808)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)(BX470248)和副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)(BX470249)等。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 LR12基因組 DNA的提取采用試劑盒法，試驗操作根據說明書進行。基因組DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置于-20℃保存備用。

1.2.2 16S rDNA序列的克隆 克隆LR12菌株16S rDNA的上游與下游PCR引物分別為YFUP(5’-GGGCACTCACAAGACCGTAT-3’)和YFDN(5’-GACAATCTGTGTGAGCACTTCA-3’)。PCR反應總體積為 20 μL，在PCR管中依次加入無菌ddH2O 15.6 μL、10× Taq酶緩沖液2.0 μL、10 mmol/L的dNTPs 0.4 μL、20 μmol/L的上下游引物各0.45 μL、25 ng/μL細菌DNA 0.5 μL和2 U/μL Taq DNA聚合酶0.6 μL。PCR程序：95℃預變性5 min；95℃ 30 s，55.9℃ 45 s，72℃ 2 min，共33個循環；循環結束后，72℃繼續延伸10 min。

1.2.3 PCR產物的回收、連接和轉化 PCR產物經電泳檢測后，采用試劑盒法回收DNA片段。回收產物與2 ×連接緩沖液、pGEM-T Easy載體(Promega)和T4DNA連接酶混合，用量分別為2.5 μL、5.5 μL、0.5 μL和1 μL，混勻后置于室溫連接2 h。用熱激法將其導入DH5α感受態細胞，經涂布培養、挑取單菌落和菌液PCR檢測后，選取3份菌液用于測序。

1.2.4 16S rDNA序列的比較 為明確LR12與其他細菌的關系,與下載自NCBI的14個細菌的16S rDNA進行比較。經多重比對后，采用鄰接法(Neighbor-joining method)用MEGA X構建系統發育樹，經1 000次自舉檢測。

2 結果與分析

2.1 16S rDNA序列的克隆

以YFUP/YFDN為引物對，利用PCR法克隆到清晰、單一的條帶，大小約1 700 bp，與預期基本一致(圖1)。經回收、連接、轉化和測序，得到核苷酸序列，PCR產物序列長度為1 714 bp，截去兩端序列后得到16S rDNA序列，全長為1 551 bp，GC為53.9%(圖2)。

注：M為DNA分子量標準；1～4為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種16S rDNA的PCR產物。
Note：M，DNA marker；1～4，PCR products of 16S rDNA ofP.carotovorumsubsp.carotovorum.
圖1LR12菌株 16S rDNA序列的克隆
Fig.1 Cloning of 16S rDNA sequence of strain LR12

2.2 序列比對

序列比對結果表明，LR12的16S rDNA序列與胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種的相似性達100%，與巴西亞種的相似性達99.9%。多重序列比對結果表明，15種細菌16S rDNA的大部分區域十分保守，但也存在一定的插入/缺失、轉換或顛換現象(圖2)。產氣克雷伯氏菌與其他14種細菌相比，在+26 bp處存在G堿基的插入；S.glossinae和居泉沙雷氏菌在+44 bp處有1個堿基的缺失，而同屬的水生沙雷氏菌在該位置的堿基為A，菊歐文氏桿菌香蕉致病變種為T，其他細菌為C；居泉沙雷氏菌和水生沙雷氏菌在+51 bp處存在堿基顛換現象，在該位置的堿基為C，而其他細菌為G。博德特氏菌屬2種細菌的16S rDNA與其他細菌差異較大，+34～+37 bp和+48～+49 bp處分別有3～4個和1～2個堿基的插入；+42 bp和+43 bp存在G?C顛換現象，+59 bp存在T?C轉換現象。LR12菌株與胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種在16S rDNA上的差異較小，僅存在2個堿基的差異，而且均為A?G轉換(圖3)。

2.3 系統發育樹

從圖4看出，15條序列的總遺傳距離為0.08。LR12與其他細菌之間的遺傳距離為0.001～0.218，其中，與胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種之間的遺傳距離最小；與P.polaris次之，為0.012；與百日咳博德特氏菌的遺傳距離最大。15種細菌在系統發育樹上可分為5組，分別分屬于果膠桿菌屬(I)、克雷伯氏菌屬(II)、狄克氏菌屬(III)、沙雷氏菌屬(IV)和博德特氏菌屬(V)。LR12與胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種的關系最近，二者聚在同一亞組，支持率達100%，并與另外2種果膠桿菌屬細菌聚于組I，但支持率僅為67%。

3 結論與討論

3.1 結論

以綠蘿葉腐病菌株LR12為材料，在提取DNA的基礎上，利用PCR法克隆其16S rDNA，并借助生物信息學技術進行分析。LR12菌株的16S rDNA全長1 551 bp，GC達53.9%，該序列與胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種的相似性最高，為100%，與巴西亞種的相似性次之，達99.9%。系統發育結果表明，15種細菌在發育樹上可分為5組，分組與傳統分類結果吻合。綠蘿葉腐病病原菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種16S rDNA的克隆與分析為后續開展分子鑒定和生產應用奠定了基礎。

3.2 討論

果膠桿菌屬由10余種細菌組成，其中的果膠桿菌(P.carotovorum)有4個亞種，分別為胡蘿卜亞種(supsp.carotovorum)、巴西亞種(subsp.brasiliense)、odoriferum亞種和獼猴桃亞種(subsp.actinidiae)等[10]。該屬細菌在侵染植物時，能產生大量的果膠酶、多聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶和蛋白酶等，用于降解和破壞植物的細胞壁，使植物組織發生軟腐[11]。果膠桿菌屬細菌的寄主十分廣泛，能危害多種蔬菜、果樹和觀賞植物。王信等從馬鈴薯(Solanumtuberosum)軟腐組織中分離到1種病原菌，結合形態、生理生化和分子方法，鑒定為山葵果膠桿菌。黃瓜細菌性軟腐病發生在葉片、莖、葉柄和果實等部位，出現流膠和濕腐現象，經鑒定該病害由胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種引起[12]。王茜等[13]從芹菜(Apiumgraveolens)中分離到1株病原菌，該細菌在實驗室條件下能侵染葉柄，在溫室條件下引起芹菜軟腐癥狀，經鑒定，該病原菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌odoriferum亞種。胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種的寄主范圍更廣，對作物的危害更大，其被列為農業生產十大病害之一[14]。臺州學院生命科學學院分子生物學實驗室前期從綠蘿葉片中分離到1株病原細菌，經離體鑒定，該病原菌能引起綠蘿葉片和葉柄發生軟腐，結合形態和生化特征，認為該細菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種。

與形態學、生理生化等標記相比，分子標記具有穩定性高、重復性好、操作簡便和多態性高等優點，近年來在細菌分類鑒定中得到廣泛應用。rDNA是一種重要的分子標記，兼具可變性和保守性等特點，高變性能反映物種的核苷酸序列特征，可用于種屬的區分[15]。16S rDNA則是細菌分子鑒定常用的rDNA序列，在果膠桿菌屬的分類鑒定中得到廣泛應用。董海龍等[16]從西葫蘆(Cucurbitapepo)莖基軟腐病病株中分離到病原菌，經測定16S rDNA，鑒定為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種。王曉麗等[17]利用通用引物擴增朝鮮薊(Cynarascolymus)根莖腐爛病病原菌的16S rDNA序列發現，其與NCBI中胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種的16S rDNA相似性高達93%。MEJA-SNCHEZ等[18]等利用16S rDNA鑒定了龜甲柱(Neobuxbaumiatetetzo)腐爛病的病原菌，該序列與胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種有99%的相似性。GAO等[19]從藥用植物獨角蓮(Typhoniumgiganteum)軟腐病株中分離病原菌，其16S序列與胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種有99%的相似性。筆者等測定了綠蘿LR12菌株的16S rDNA，該序列與胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種的相似性達100%，證實綠蘿葉腐病由該亞種引起。