豬圓環病毒3型PCR診斷方法的建立及初步應用

姜玲玲，徐 雨，余國富，魏賜開，唐遠江，盧昱希，蒲 齡，楊 莉，余 波*

(1.貴州省農業科學院 畜牧獸醫研究所，貴州 貴陽 550005; 2.貴州省關嶺縣畜牧服務中心，貴州 關嶺 561000; 3.貴州省清鎮市動物疫病預防控制中心，貴州 清鎮 551400; 4.貴州省甕安縣農業農村局，貴州 甕安 550400)

豬圓環病毒(Porcine circovirus，PCV)屬于圓環病毒科、圓環病毒屬，為單股負鏈環狀DNA病毒，是獸醫學上迄今發現的最小的病毒。根據PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列將PCV分為PCV1和PCV2兩種血清型，其中PCV1不具有致病性，而PCV2能引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、豬增生性壞死性肺炎及其他豬圓環病毒相關疾病[2-3]。2016年10月PALINSKI等首次從有類似劇烈豬皮炎腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)癥狀的死亡母豬身上利用宏基因組測序技術鑒定出一種新的圓環病毒即豬圓環病毒3型(PCV3)以來，1年多的時間里PCV3已經在亞洲、歐洲、美洲的許多國家和地區被檢測到。KU等對中國11省1直轄市和地區35個農場的222份樣品進行PCV3的PCR檢測，陽性農場占比68.6%，表明PCV3已經在中國廣泛流行。FU等對中國2015-2017年收集的中國南方部分省份臨床樣品進行的檢測結果顯示，養殖場陽性率從 41.2%上升到60.5%，樣品陽性率從21.9%上升到26.7%，而且存在混合感染情況，PCV3陽性樣品與PCV2的共感染率達22.3%，增加了該病的防控難度。邢廣源采用常規PCR檢測方法對不同日齡、不同組織器官進行檢測，結果顯示PCV3檢出率最好的組織器官為淋巴結，其次為肺、扁桃體、腎、腦等組織，表明PCV3對動物的危害范圍廣。徐國等首次證實貴州省存在PCV3。2018-2019年對貴州各屠宰場進行PCV3核酸檢測，2018年陽性率為14.2%，2019年陽性率為11.6%，表明貴州屠宰場PCV3感染率較高。

PCV3基因組包含2000 bp，具有與PCV1和PCV2相似的基因組結構[9-11]，PCV3病毒可能與PCV相關性疾病相關，在臨床上表現為仔豬斷奶后出現多系統衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)和豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)。目前尚未見報道分離到PCV3活毒株，對其理化性質了解較少。PALINSKI R在豬睪丸細胞和豬腎細胞(PK-15)進行細胞分離，未觀察到細胞病變，間接免疫熒光檢測也無明顯熒光?，F對PCV3檢測的主要方法包括宏基因組、常規PCR、多重定量實時聚合酶鏈反應(mq PCR)、Taq Man實時PCR、實時重組酶聚合酶擴增(rt-RPA)、間接ELISA等，其中，常規PCR在實驗室快速診斷中的應用越來越普遍[12-13]，然而PCV3在屠宰場的流行情況報道較少。因此，筆者等進行了PCV3的PCR診斷方法研究，為PCV3在屠宰環節的分子流行病學調查研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 毒株 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)和豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)DNA模板由貴州省畜牧獸醫研究所保存。

1.1.2 病料組織 采自 2018-2019年貴州省甕安縣、鎮遠縣、晴隆縣、關嶺縣、貴陽市烏當區和清鎮市等7個屠宰場，共采集樣品376份，包括豬淋巴結和肺臟。

1.1.3 主要試劑 DNA提取試劑盒(廈門百維信生物科技有限公司)，2×TaqMaster Mix和Goldview(天根生化科技有限公司)，DL 2000Marker、DL 1000 Marker(大連寶生物工程有限公司產品)。

1.2 PCR檢測方法的建立

1.2.1 引物設計與合成 參照文獻中的引物和Gen Bank中已公布的參考序列設計 1對引物，引物序列為:PCV3-F:5′-TTACTTAGAGAACGGACTTG

TAACG-3 ′，PCV3-R:5′-AAATGAGACACAGAGCTAT

ATTCAG-3′，目的片段為649 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 DNA模板提取 取病料組織約0.1 g，加入600 μL滅菌生理鹽水置于2 mLEP管后，采用上海凈信組織研磨儀研磨1 min后，將EP管于4 000 r/min離心3 min。用移液器吸取上層研磨液200 μL，加入蛋白酶K 5 μL，10%SDS溶液20 μL，搖勻置于55℃水浴鍋2 h后，用移液器吸取上層溶液200 μL置于DNA提取試劑盒第一孔，加入30 μL DTT溶液(1 mol/L)，用Lab-Aid820核酸提取儀進行自動提取[14]。

1.2.3 PCV3陽性模板的制備 以1.2.2提取的樣品DNA為模板，用引物PCV3 F和PCV3R進行PCR反應，將大小為649 bp的目的片段切膠回收，送上海生工生物工程有限公司測序鑒定。

1.2.4 PCR反應條件優化 對退火溫度(50℃、55℃、60℃、65℃)、延伸時間(60 s、65 s、70 s、75 s)、引物量(0.5 μL、1 μL)、模板量(1 μL、2 μL、3 μL)等4個變量對PCR檢測方法進行優化，獲得最佳反應條件。

1.2.5 PCR特異性檢測 用1.2.3建立的PCR方法擴增豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)，并以陽性質粒和超純水依次作為陽性和陰性對照，檢測該PCR方法的特異性。

1.2.6 PCR敏感性試驗 采用Nanophotometer核酸儀測定陽性模板的濃度，進行敏感性試驗，將模板進行倍比稀釋后，分別取2 μL作模板進行擴增。

1.3 臨床樣品PCR檢測

將2018-2019年采集的豬肺組織、淋巴結等376份病料組織按1.2.3建立的PCR方法進行PCV3檢測。

2 結果與分析

2.1 陽性模板

用引物PCV3 F和PCV3 R對樣品進行擴增，得到與預期相符的649 bp的目的條帶(圖1)。測序結果與NCBI公布的PCV3/CN/Jiangxi-62-2016毒株的同源性達99.54%，表明該DNA可作為陽性模板。

注：1為陰性對照，2為陽性模板，M為Marker DL2 000。
Note: 1，negative control; 2，positive template; M，Marker DL2 000.
圖1PCV3的 PCR擴增結果
Fig.1 PCR amplification of PCV3

2.2 PCR反應條件的優化

經條件優化，確定PCR最佳反應為2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，2 μL模板，dd H2O 8.5 μL。PCR反應條件為94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環，72℃延伸5 min。擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.3 PCR優化方法的特異性

利用建立的最優PCR反應條件，對PRRSV、PRV、PPV進行擴增。結果(圖2)表明，建立的PCR方法只能擴增出PCV3樣品中的特異性目的片段，而對PRRSV、PRV、PPV均擴增不出目的片段，建立的PCR方法特異性較好。

注：1為PRRSV病毒，2為PRV病毒，3為PPV病毒，4為陰性對照，5為PCV3陽性對照，M為Marker DL2 000。
Note：1，PRRSV virus; 2，PRV virus; 3，PPV virus; 4，negative control; 5，PCV3 positive control; M，Marker DL2 000.
圖2PCR特異性檢測結果
Fig.2 PCR specific detection results

2.4 PCR優化方法的敏感性

測得陽性模板濃度為143.5 ng/μL，則不同稀釋度模板濃度依次為1.43×105pg/μL、1.43×104pg/μL、1.43×103pg/μL、1.43×102pg/μL、1.43×10 pg/μL、1.43 pg/μL。用建立的最優化PCR反應條件，對不同稀釋度的模板進行PCR擴增，結果(圖3)表明，建立的不同模板濃度PCR擴增條帶隨模板濃度降低而逐漸減弱。

注：M為 Marker DL1000，1～6濃度依次為1.43×105pg/μL、1.43×104pg/μL、1.43×103pg/μL、1.43×102pg/μL、1.43×10 pg/μL、1.43 pg/μL；7為陰性對照。
Note：M，Marker DL1000; 1～6 means 1.43×105pg/μL，1.43×104pg/μL，1.43×103pg/μL，1.43×102pg/μL，1.43×10 pg/μL and 1.43 pg/μL respectivey. 7，negative control.
圖3PCR敏感性檢測結果
Fig.3 PCR sensitivity detection results

2.5 PCR優化方法的臨床樣品檢測

用建立的最優化PCR反應條件對2018-2019年貴州各屠宰場376份組織的檢測結果(表1)顯示，其檢測出陽性樣品46份，2018年和2019年的陽性率分別為14.2%和11.6%。

表1 2018-2019年試驗樣品 PCV3檢測結果Table 1 Detection results of tested PCV3 samples in 2018 and 2019

3 結論與討論

根據豬圓環病毒3型(Porcine circovirus type 3，PCV3)特異性序列設計引物，通過敏感性試驗、特異性試驗、重復性試驗及測序驗證后，建立的PCR方法確定PCR最佳反應為2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，2 μL模板，dd H2O 8.5 μL。PCR反應條件為94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環，72℃ 延伸5 min。特異性擴增出649 bp的目標片段，具有較好的敏感性，可擴增的最低模板濃度為0.143 ng/μL；用建立的PCR方法對屠宰場送檢的376份組織樣品的檢測顯示，PCV3平均陽性率為12.9%，建立的PCR診斷方法較好。

目前，PCV3感染尚未列入世界動物衛生組織(OIE)通報性疫病名錄及《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》，該病毒隨生豬及其產品國際貿易傳播風險尚待評估[15]，且該病目前沒有疫苗，如毒力或致病力發生變化，屠宰場將是一個重要傳播源。試驗建立了PCR診斷方法，對貴州多個屠宰場進行檢測，將為PCV3在屠宰環節的分子流行病學調查研究奠定基礎。