雞傳染性喉氣管炎重組雞痘病毒基因工程疫苗凍干工藝探索

胡江鋒

摘? 要：為篩選出理想的雞傳染性喉氣管炎重組雞痘病毒基因工程疫苗的凍干工藝，保證疫苗產品質量及免疫效果，更好地服務于畜牧業。本試驗從凍干保護劑配方與凍干曲線入手，將含有0.8%、1.0%、1.2%、1.5%的明膠5%蔗糖保護劑分別與表達雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因的重組雞痘病毒（rFPV_ILTVgB）抗原按規定配比，分別在21、24.5、28 h的凍干曲線下完成凍干，并對凍干后的制品檢測其效價、真空度、剩余水分及物理性狀。結果表明，有1.0%明膠5%蔗糖保護劑24.5 h或28 h凍干曲線和1.2%明膠5%蔗糖保護劑28 h的凍干曲線三種凍干工藝，其制品效價、真空度、剩余水分、物理性狀均符合標準。因而采用1.0%明膠5%蔗糖的保護劑配方及24.5 h的凍干曲線是該制品較為理想的凍干工藝。

關鍵詞：雞傳染性喉氣管炎重組雞痘病毒基因工程疫苗;保護劑配方;凍干曲線

近幾年，人民生活水平日益提高，對畜產品的需求不斷增大，而保障畜禽安全尤為重要，獸用疫苗在預防疫病方面發揮著舉足輕重的作用，因凍干制品不但會延長了制品的保存期，而且作為基礎免疫廣泛使用。冷凍干燥技術是指把欲凍溶液在低溫下凍結，然后在真空條件下升華干燥，除去冰晶，待大量水分升華結束后再進行解析干燥，除去部分結合水的干燥方法。凍干時需添加一些輔助物，在干燥后起支撐與保護制品作用，該種物質稱為凍干保護劑。在獸用生物制品保護劑中，常用的有牛奶、蔗糖和明膠。由于明膠蔗糖保護劑成本低、制備容易、保存方便及與抗原配比時用量小，可增加凍干苗的單位（瓶）產量等優點[1]。本試驗選擇不同濃度的明膠5%蔗糖保護劑與表達雞傳染性喉氣管炎病毒重組雞痘病毒（rFPV_ILTVgB）按規定配比混勻后，采用不同凍干曲線進行制品凍干試驗，旨在篩選出理想的雞傳染性喉氣管炎重組雞痘病毒基因工程疫苗的凍干工藝（即設定凍干機板層的不同溫度及其經過時間），以保障獸用疫苗的產品質量。

1? 材料與方法

1.1? 主要設備? GLZZQ-1型凍干機，北京速原真空技術有限公司;真空干燥箱（BZX-6090），上海福瑪實驗設備有限公司。

1.2? 病毒液? 按《雞傳染性喉氣管炎重組雞痘病毒基因工程疫苗制造及檢驗試行規程》中方法[2]生產其合格病毒液，來源于楊凌綠方生物工程有限公司凍干苗車間細胞班，批號20190403。

1.3? 明膠? 分析純，國藥集團化藥試劑有限公司，批號F20180620。

1.4? 凍干樣品制備

1.4.1? 將已滅菌的含有0.8%、1.0%、1.2%、1.5%明膠5%蔗糖保護劑分別與表達雞傳染性喉氣管炎病毒重組雞痘病毒液按規定的配比混勻后，分裝于10 mL西林瓶，2.5 mL/瓶，分別在21、24.5、28h的凍干曲線下凍干，凍干后抽樣檢驗，凍干曲線見圖1、2、3。

如圖1所示，凍干機開機后，把其板層溫度降到7 ℃，分裝產品的西林瓶裝進凍干機板層上，經過1.5 h將板層溫度降到-40 ℃，維持1.5 h完成產品凍結;在1.5 h內將板層升溫至-5 ℃，維持9.5 h完成產品升華干燥;在2.5 h內將板層升溫至28 ℃，維持4.5 h完成產品解析干燥后，結束產品凍干過程。

如圖2所示，凍干機開機后，把其板層溫度降到7 ℃，分裝產品的西林瓶裝進凍干機板層上，經過1.5 h將板層溫度降到-40 ℃，維持1.5 h完成產品凍結;在1.5 h內將板層升溫至-5 ℃，維持13 h完成產品升華干燥;在2h內將板層升溫至28 ℃，維持5 h完成產品解析干燥后，結束產品凍干過程。

如圖3所示，28 h凍干曲線，凍干機開機后，把其板層溫度降到7 ℃，分裝產品的西林瓶裝進凍干機板層上，經過1.5 h將板層溫度降到-40 ℃，維持1.5 h完成產品凍結;在1.5 h內將板層升溫至-5 ℃，維持16.5 h完成產品升華干燥;在1.5 h內將板層升溫至28 ℃，維持5.5 h完成產品解析干燥后，結束產品凍干過程。

1.4.2? 按1.4.1方法再重復凍干兩次。

1.5? 凍干制品檢測

1.5.1? 物理性狀、真空度及剩余水分檢測? 按《中華人民共和國獸藥典》中方法[3]及標準[5]進行。合格標準認定：物理性狀，淡黃色疏松團狀，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解成粉紅色液體;真空度，將高頻火花真空測定器指向容器內無制品的部位，容器內出現白色或粉色或紫色輝光;剩余水分，應不超過4%[4]。

1.5.2? 效價測定? 按《雞傳染性喉氣管炎重組雞痘病毒基因工程疫苗制造及檢驗試行規程》中方法[2]及標準[5]進行。合格標準：雞傳染性喉氣管炎要達對照雞≥7/10發病，免疫雞≥7/10保護;雞痘每羽份病毒含量≥1.0×104 PFU。

2? 結果

凍干制品的檢測結果見表1、2、3。

從表1看出，此凍干曲線下，只有選用1.0%明膠5%蔗糖保護劑凍干的制品效價、真空度、物理性狀均合格，但是剩余水分含量高于國標4.0%[4]，綜合判定全為不合格制品。

從表2看出，此凍干曲線下，只有選用1.0%明膠5%蔗糖保護劑凍干的制品的效價、真空度、剩余水分、物理性狀均合格。

從表3看出，此凍干曲線下，選用1.0%、1.2%明膠5%蔗糖保護劑凍干的制品效價、真空度、剩余水分、物理性狀均合格。

3? 結論

從凍干制品測定結果可以看出，選用1.0%明膠5%蔗糖保護劑24.5 h或28 h凍干曲線及選用1.2%明膠5%蔗糖保護劑28 h的凍干曲線的凍干制品，檢測其效價、真空度、剩余水分、物理性狀均能達到制品質量指標[5];又從經濟效益及生產組織方面考量，24.5 h凍干時間縮短，減輕了設備損耗，降低動力運行費用，生產組織比較便利，而且1.0%的明膠減少了材料消耗成本，因此綜合判定1.0%明膠5%蔗糖保護劑24.5 h凍干曲線為該產品較理想的凍干工藝。

本試驗為各企業確定生產環節的凍干工藝，提供了實驗數據的參考，建議結合企業自身實際，靈活運用。但有關凍干過程中的升華溫度和時間對制品質量的影響，有待進一步探索，以不斷提升該產品凍干工藝水平，提高產品質量。

參考文獻：

[1]? 傅德霞，衣寧，賈華強，等.兩種凍干保護劑在禽病疫苗生產中的效果比較[J].中國獸藥雜志， 1997，（03），10-12.

[2]? 中華人民共和國農業部. 雞傳染性喉氣管炎重組雞痘病毒基因工程疫苗制造及檢驗試行規程[S].北京：中華人民共和國農業部，2005.

[3]? 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（2015年版）[M]. 北京：中國農業出版社，2016.

[4]? 農業部獸用生物制品規程委員會.中華人民共和國獸用生物制品規程（2000年版）[S].北京：化學工業出版社，2001.

[5]? 中國獸藥典委員會.獸藥質量標準：生物制品卷（2017年版）[S].北京：中國農業出版社，2017.

□