miR?214抑制牙囊細胞成骨分化的體外研究

王智亨，左婕，王夢琪，朱少軍，劉奕杉

新疆醫科大學第一附屬醫院（附屬口腔醫院）兒童口腔科-口腔預防科，新疆維吾爾自治區口腔醫學研究所，新疆維吾爾自治區烏魯木齊（830054）

1 材料和方法

1.1 主要試劑

α-MEM培養液、PBS緩沖液、胎牛血清及2.5 g/L胰蛋白酶、opti-MEM、雙抗（Hyclone，美國）；谷氨酰胺和Ⅰ型膠原酶溶液（Gibco，美國）；β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸（Sigma，美國）；lipofectamine 3000（Invitrogen，美國）；miR-214-3p mimics（5′-ACAGCAGGCACAGACAGGCAG-3′，5′-GCCUGUCUGUGCCUGCUGUUU-3′）、miR-214-3p inhibitor（5′-CUGCCUGUCUGUGCCUGCUGU-3′）和染料法Hairpin-it miRNAs定量和U6校準qRT-PCR試劑盒（吉瑪，上海）；熒光定量試劑盒、反轉錄試劑盒和RIPA裂解液、ECl顯色液、AP顯色液（Thermo，德國）；RUNX-2抗體、β-actin抗體、β-catenin抗體、山羊抗兔熒光二抗（Abcam，美國）、兔抗鼠熒光二抗（中杉金橋，中國），茜素紅（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 牙囊細胞的分離與培養

取3～4日齡SD大鼠的乳鼠（動物合格證號：SCXK（新）2013-0002，新疆醫科大學動物實驗中心）脫頸處死，75%酒精浸泡5 min，取雙側下頜骨，PBS沖洗，洗凈血液，剝除頜骨多余肌肉組織，置于裝有α-MEM的培養皿中，顯微手術器械剝離牙胚，體視顯微鏡下剝離牙胚表面牙囊，剪碎，吸取置15 mL離心管中，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清，置2 mL胰酶于離心管中重懸組織碎片。將離心管至于37℃水浴鍋中震蕩5 min，加入4 mLⅠ型膠原酶。將離心管至于37℃搖床中，200 r/min消化35min。置4 mL完全培養基終止消化，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清。以10 mL完全培養基（含有15%FBS、1%雙抗及1%谷氨酰胺，以α-MEM配制）重懸離心管底部細胞團塊，至于培養瓶中放入37℃，含有飽和濕度及體積分數5%二氧化碳的細胞培養箱中，12～15 h換液，雙向差速傳代法純化牙囊細胞，此前本課題組已進行鑒定［10］，傳代至第3～4代備用。

1.3 轉染與成骨誘導

轉染前一天取3～4代牙囊細胞接種于6孔板中，確保細胞處于對數生長期，24 h內可生長至70%，棄去原培養基，PBS沖洗3次，每孔加入完全培養基1.5 mL待用。……