HPLC-ELSD 一測多評法同時測定蜂蜜中4 種糖類成分

凌 真，劉 慧，丁蘇蘇，姚晶晶，朱慶麗

揚州市食品藥品檢驗檢測中心，揚州225009

蜂蜜是一種藥食同源類物質，其成分主要包括果糖、葡萄糖這兩種單糖，以及少量的蔗糖、麥芽糖等雙糖，另含有微量的有機酸、氨基酸、礦物質和水分等。蜂蜜的質量因蜜源與環境的不同而具有較大的差異，主要表現在糖分的組成及含量不同。由于蜂蜜的市場需求旺盛，有不法商販對蜂蜜制偽摻假牟取暴利。因此，建立一種準確快速的方法來檢測蜂蜜中主要的單、雙糖成分含量，對于蜂蜜質量的監管具有重要意義[1，2]。

現行國家法定標準中，主要有兩種檢測蜂蜜單、雙糖含量的方法，《中國藥典》[3]收錄的為高效液相色譜示差折光檢測法（RID），《GB14963-2011 食品安全國家標準蜂蜜》（以下簡稱《國標》）[4]收錄的為RID和高效液相色譜蒸發光散射檢測法（ELSD）。要求果糖和葡萄糖總含量≥60%，蔗糖含量≤5%（少數蜂蜜除外）；《中國藥典》 還要求麥芽糖含量≤5%且果糖與葡萄糖的含量比值不得＜1.0。上述標準的適用條件均有所局限：如RID 對溫度變化極其敏感，基線穩定時間長，檢測靈敏度較低，而《國標》中ELSD法檢測范圍較窄，故本研究擬建立一種靈敏的ELSD法同時測定蜂蜜中的4 種單、雙糖成分。

1 儀器與試藥

Agilent 1260、U 3000 高效液相色譜儀；Alltech 2000 ES、Alltech 3300 蒸發光散射檢測器；梅特勒XS 205 DU 電子分析天平；Milli-Q 純水機。

蜂蜜樣品12 批，市售；對照品：果糖（批號C13947500，純度99.7%）、葡萄糖（批號C14027000，純度99.7%）、蔗糖（批號C16901100，純度99.9%）、麥芽糖（批號C14734700，純度99.4%）均購自德國Dr.E GmbH 公司；乙腈為色譜純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 方法學考察

2.1.1 色譜條件 Prevail Carbohyrate ES 色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（78∶22）；流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；蒸發光散射檢測器；載氣：氮氣；流速：3.0mL·min-1；漂移管溫度：105℃；進樣量：10μL。結果顯示各組分分離良好，色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取各種對照品：果糖1.1460 g、葡萄糖1.0906 g、蔗糖0.7060 g 和麥芽糖0.7886 g，置同一50 mL 量瓶中，加水適量使溶解，再用水稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備溶液。精密吸取對照品儲備溶液2.5 mL，置100 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液（7），再精密吸取對照品溶液（7）1.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、8.0 mL 分別置10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為對照品溶液（1）～（6）。

2.1.3 供試品溶液的制備 取蜂蜜樣品0.5 g，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加水適量溶解，再用水稀釋至刻度，搖勻；精密吸取該液5 mL，置100 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下的對照品溶液（1）～（7）各10 μL，注入高效液相色譜儀，以各對照品溶液質量濃度的對數lgC（mg·mL-1）為橫坐標X，以峰面積的對數lgA 為縱坐標Y，繪制標準曲線，結果見表1。4 種糖類線性關系良好。

表1 各被測組分的回歸方程、相關系數（r）和線性范圍

2.1.5 精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液（3）10 μL，按照“2.1.1”項下色譜條件，連續進樣6 次，記錄峰面積，并計算對數值，結果這4 種糖類的RSD 分別為0.25%、0.36%、0.44%、0.77%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 精密吸取“2.1.3”項下的供試品溶液10 μL，按照“2.1.1”項下色譜條件，分別于0 h、3、8、10、12、24、30 h 進樣，記錄峰面積，得4 種成分的RSD 分別為0.49%、0.64%、0.47%、0.68%，表明供試品溶液在30 h 內穩定。

2.1.7 加樣回收率試驗 取已知含量的蜂蜜樣品0.5 g，共6 份，精密稱定，置50 mL 量瓶中，精密量取對照品儲備溶液各5 mL 置上述量瓶中，按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的平均回收率（n=6）分別為97.5%、103.2%、98.1%、95.2%，RSD 分別為0.61%、1.02%、1.73%、2.92%，表明4 種糖類回收率符合要求。

2.2 一測多評法評價研究[5，6]

2.2.1 相對校正因子的計算[7]以果糖為內參物，以公式Fs/k=（Ms×lgAk）/（Mk×lgAs）（Ms為內參物質量，Mk為待測物質質量，lgAs為內參物峰面積的對數，lgAk為待測物質峰面積的對數），計算果糖對葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的相對校正因子，結果見表2。

表2 蜂蜜中3 種糖類相對校正因子的測定結果

2.2.2 高效液相色譜儀考察 由表3 可見，不同儀器以及不同實驗室條件下，果糖對葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的相對校正因子分別為0.921、1.418、1.095，相對偏差＜2%，表明本方法重現性良好。

表3 不同高效液相色譜儀-蒸發光檢測器測定的相對校正因子

2.2.3 待測組分色譜峰的定位考察 測定葡萄糖、蔗糖、麥芽糖對于內參物果糖的相對保留時間（tR），完成對待測組分色譜峰的定位，由表4 可見，在不同儀器上其tR的相對偏差均＜2%，表明利用tR進行色譜峰的定位是可行的。

表4 不同高效液相色譜儀-蒸發光檢測器測定的相對保留時間

2.3 一測多評法與外標法測定結果比較

有市售蜂蜜12 批，分別取0.5 g，精密稱定，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，采用一測多評法和外標法計算蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的含量，樣品中均未檢出蔗糖和麥芽糖；葡萄糖含量經t 檢驗比較，t＞0.1，表明外標法實測值與一測多評法計算值的差異無統計學意義，說明一測多評法可用于蜂蜜中葡萄糖等糖類成分的質量評價研究，見表5。

3 討論

蜂蜜的主要成分是糖類，此類成分無紫外吸收，《中國藥典》 選用通用型檢測器RID，但是RID受溫度影響較大，靈敏度較低，所以本研究選用ELSD 為檢測器。在色譜柱的選擇中，比較了氨基色譜柱和Prevail Carbohyrate ES 色譜柱：氨基柱柱效下降較快，不利于大量樣品的測定；《中國藥典》推薦Prevail Carbohyrate ES 色譜柱為測定專用柱，在本試驗中分離效果好，柱效高，耐用性強。

表5 外標法（ESM）與一測多評法（QAMS）測定結果

在柱溫的選擇中，溫度較低，分離度較差；溫度較高，峰形不夠理想，所以柱溫選擇為30 ℃。在含量計算中，選擇以質量濃度的對數值和峰面積的對數值描繪標準曲線，求得兩者的線性關系。

引入一測多評法，以果糖為內標物，測評蜂蜜中其他3 種糖類成分，以峰面積的對數值代替峰面積進行相對校正因子的計算，研究了不同高效液相色譜系統對相對校正因子和相對保留時間的影響，結果重現性良好，驗證了一測多評法在蜂蜜質量控制中的可行性。將外標法測定的結果與一測多評法計算所得的結果相比較，無顯著性差異，確證了該方法的準確性和科學性。