臍帶間充質干細胞治療CIA 大鼠的療效觀察*

姚 瑤，葛衛紅，曹 娟，丁從珠**

南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 1 藥學部；2 老年科，南京210008

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因不明的自身免疫疾病，在世界范圍內發病率約為0.5%，在我國為0.4%，炎癥和骨破壞為RA 的兩大主要病理表現[1]。目前的治療藥物僅能改善病情進展，不能治愈疾病。間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是來源于中胚層的具有高度自我更新能力和多項分化潛能的多能干細胞，具有強大的免疫抑制和誘導免疫耐受功能，表現出抑制炎癥增殖的特性，能夠改善免疫系統紊亂引起的慢性炎癥。MSC 已陸續在美國、加拿大、韓國、瑞士和日本等9 個國家批準上市，用于治療系統性紅斑狼瘡等多種自身免疫疾病[2]；但是它對類風濕關節炎的治療仍存爭議。本研究即通過體內研究，觀察MSC 治療膠原誘導關節炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠的效果，為類風濕關節炎的治療提供證據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

8 周齡SPF 級健康SD 大鼠50 只，雌性，體質量150～170 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產許可：SCXK（京）2016-0011，南京鼓樓醫院動物實驗中心飼養，適應性喂養3 天后用于實驗。

1.2 儀器和試劑

水平式離心機（美國Wealtec 公司）；全自動酶標儀（美國Thermo 公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；超凈工作臺（北京半導體設備一廠）；病理組織切片機（上海徠卡儀器有限公司）。

細胞培養液、胰蛋白酶、青鏈霉素（批號：12100046、25200-056、15070063，均 為GIBCO 公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料公司）；甲氨蝶呤（MXT，陽性對照藥，批號：170102，上海信誼藥業）；II 型膠原酶、白介素-17（IL-17）、NFκB 配位體受體活化劑（RANKL）、可溶性蛋白骨保護素（OPG）、轉化生長因子-β（TGF-β）試劑盒（均美國Sigma 公司）。

1.3 間充質干細胞制備

經知情同意后取得人源臍帶，無菌條件下浸入DMEM/F12 培養液中，超凈工作臺內PBS 沖洗，將臍帶剪碎至1～2 mm3組織塊，轉移至0.075%膠原酶Ⅱ溶液中，37 ℃攪拌消化30 min，PBS 再次清洗后，用0.125%胰酶37 ℃消化30 min。100 μm 細胞篩過濾，濾液離心，PBS 沖洗2 次。以1.0×106/cm2的密度接種于含L-DMEM 培養液的塑料培養瓶中，3～4 天更換培養液，去掉未貼壁細胞，以后每3 天換液1次。待細胞生長到80%左右融合時，顯微鏡下觀察細胞的生長形態，確認細胞狀況良好，符合移植要求后，以0.25%胰蛋白酶/EDTA 混合液消化，再用含10%小牛血清的DMEM 培養液清洗2～3 次，制成1.0×106/mL 細胞懸液以備移植用。

1.4 大鼠關節炎模型的制備

50 只SD 大鼠稱重后，隨機分為空白組10 只，其余40 只造模。將溶于醋酸的Ⅱ型膠原酶先于4 ℃低溫保存過夜，第二天與完全弗氏佐劑以等體積乳化。乳化成功后，對擬造模的大鼠背部及尾部多點皮下注射，每只注射0.15 mL，誘導類風濕關節炎模型。首次注射的7 天后進行第二次注射，方法與首次注射相同。空白對照組按照相同方法注射等量0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）。

1.5 關節評分

首次免疫注射后每3 天稱重1 次，每次固定兩名實驗員記錄關節腫脹評分。關節腫脹評分標準：0 分為關節處無腫脹；1 分：趾關節微腫；2 分：趾關節及足趾處發生腫脹現象；3 分：踝關節以下的足爪發生腫脹現象；4 分：全部足爪腫脹（包括踝關節）。最終分數為大鼠四肢關節腫脹分數的總和，最高分為16 分。

1.6 藥物治療方案

首次免疫注射后第10 天關節腫脹大于4 分的大鼠認為造模成功，將成模大鼠隨機分為：①MSC治療組，予大鼠尾靜脈注射1×106個MSC[3]；②模型組，予大鼠尾靜脈注射等體積的生理鹽水；③MTX陽性對照組，灌胃給予MTX（3.8 mg·kg-1），每周一次。④設空白組，于正常的SD 大鼠尾靜脈注射等體積的生理鹽水。實驗共持續治療4 周。為了評估MSC 的短期和長期治療效果的差異，另設MSC 7天治療組。

1.7 炎癥因子測定

實驗結束后，禁食一夜，次日于大鼠眼眶取血，ELISA 法測定血清中IL-17、RANKL、TGF-β 以及OPG 水平，按試劑盒說明書操作。

1.8 組織HE 染色

實驗結束處死大鼠，分離大鼠后足關節，標本經10%甲醛固定后，常規石蠟包埋，4 μm 切片，HE染色。醫學顯微鏡下作組織學觀察。

1.9 統計學方法

采用SPSS19.0 統計軟件分析，數據以均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析，最小顯著差數（LSD）法進行兩兩比較。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 關節炎評分

每3 天由兩名實驗員分別對大鼠進行關節評分一次，得分取平均值，實驗共進行4 周，關節炎評分走勢圖見圖1。

因藥物治療效果有一定的延遲，在治療10 天左右，關節評分達到一個高峰，之后模型組評分也略有下降；但MSC 尾靜脈輸注和甲氨蝶呤灌胃均可以降低CIA 大鼠關節炎評分。實驗完成前模型組關節炎評分為8.8±1.3，MSC 組為2.4±1.1，顯著低于模型組（P＜0.05）；MTX 治療組關節炎評分為2.6±0.9；表明降低關節炎的作用，MSC 組與陽性對照MTX組無統計學差異（P＞0.05）。

2.2 大鼠血清細胞因子測定

CIA 大鼠尾靜脈輸注MSC 治療RA（106個/只），實驗結束測定大鼠血清中IL-17、RANKL、OPG、TGF-β、OPG 等細胞因子水平，見表1。

表1 各組大鼠血清IL-17、RANKL、TGF-β 水平（n=8）

以模型組和空白組作對照，甲氨蝶呤為陽性對照。結果提示：①模型組IL-17、RANKL、TGF-β 水平高于空白組（P＜0.05），驗證造模成功。②經治療，與模型組相比，MSC 組顯著降低RANKL、TGF-β 水平，顯著提高OPG 水平（P＜0.05）。③MSC 組對IL-17 的降低作用弱于甲氨蝶呤組，且僅維持較短時間，對OPG 的提高作用強于甲氨蝶呤組。

2.3 關節HE 染色

HE 染色結果顯示（見圖2），模型組關節炎性細胞侵潤，已將腔隙填滿（圖2A），且血管翳清晰；空白組（圖2B）邊界清晰，軟骨完好；MSC 治療7 天組軟骨組織完好，但間隙狹窄（圖2C）；MSC 治療28 天組（圖2D）與空白組差異小，且與MTX 組（圖2E）效果相當。

3 討論

目前RA 的治療主要為改善病情的抗風濕藥（DMARDs），傳統DMARDs 有甲氨蝶呤，為國內外“指南”推薦的一線治療藥物；但是藥物起效慢、個體差異大、不良反應多。近年來TNF-α 抑制劑Etanercept、IL-6 受體拮抗劑Tocilizumab 等生物抗風濕藥應用于臨床，可有效改善病情；但仍有近1/3 的患者不能從中獲益，更棘手的是，疾病早期即可出現關節破壞，一旦發生，尚無有效的恢復途徑，因此亟需探索修復RA 關節損傷的新型療法。MSC 是一類具有高度自我更新和多向分化潛能的多能干細胞，可在特定條件下分化為成骨細胞、軟骨細胞、神經元等，是組織修復的重要細胞；MSC 還兼有免疫抑制、抗炎、抗纖維化等功效。以此為基礎，MSC 移植治療組織損傷和自身免疫性疾病成為研究熱點。

本研究結果提示，MSC 與MTX 治療效果相近，均能有效改善CIA 大鼠關節腫脹指數。Wang YH等[4]的研究顯示，MSC 能夠有效改善CIA 大鼠癥狀，且與MTX 聯用可以提高治療效果。邊振宇[5]作RA大鼠模型實驗，分別進行關節內、經靜脈全身性注射以及關節內注射聯合靜脈全身注射MSC，結果表明，3 種方式均可降低RA 模型的關節炎指數，聯合治療效果更佳。與本研究結果吻合。

既往的研究提示，MSC 可以通過調節T 淋巴細胞，發揮免疫調節作用，具體表現為抑制T 淋巴細胞的增殖和活化[6]，這可能也是其治療類風濕關節炎的重要機制之一。MSC 通過抑制細胞分裂，使T淋巴細胞阻滯于G0/G1 期，一是通過細胞間相互作用；二是通過可溶性細胞因子實現，MSC 分泌的可溶性細胞因子（TGF-β、HGF、IL-6、IL-10、PGE2、NO、IDO 等）作用于T 淋巴細胞間抑制其增殖能力與活性[7]。對于TGF-β 的研究爭議較多，既往認為它是一種抑炎因子。趙成等[8]的研究提示，MSC 可能通過抑制促炎因子IL-6、IL-1 和TNF-α，以及上調抑炎因子TGF-β 來發揮抗炎作用。但是，近年來的研究卻又指出，TGF-β 參與RA 滑膜成纖維細胞的遷移和浸潤，是導致RA 發病的重要炎癥因子[9]。Liu Y 等[10]的研究提示，MSC 主要是通過抑制TGF-β 分泌，抑制T 細胞活性，發揮治療RA 的作用。在本研究中，MSC 尾靜脈輸注后能夠顯著降低TGF-β 水平，與Liu Y 等研究結論一致。除了滑膜成纖維細胞，Th17 細胞也是參與RA 發病的關鍵。Kim KW等[11]的研究表明，MSC 可以抑制RA 患者Th17 細胞的作用，降低IL-17 水平。但是在本研究中，治療一周后IL-17 水平顯著下降，且隨著時間的推移，MSC對IL-17 的調節作用減弱，總體效果弱于MTX，這可能與MSC 的給藥頻次和劑量有關。

MSC 除了具有免疫調節作用外，還具有多向分化潛能，是RA 組織修復的理想種子細胞[12]。本研究雖然未直接觀測到MSC 的歸巢和成骨分化，但是結果提示，MSC 能夠上調OPG 分泌，降低RANKL 的水平，從而抑制破骨細胞分化，促進成骨細胞的生成。同時，從HE 染色結果看，隨著時間的推移，MSC能夠抑制關節破壞的進程，其治療效果與MTX 類似。有研究還發現，MSC 常規分泌大量OPG，在向破骨細胞誘導體系中加入MSC 或MSC 上清液后，破骨細胞的數量及cathepsin K、NF－ATc1 等破骨細胞分化關鍵基因的表達均受到顯著抑制，這種抑制趨勢與OPG 的水平呈正相關[13]。MSC 通過持續分泌OPG，在體外有效抑制了破骨細胞的分化。以上研究一定程度表明，當RA 急性期的強烈炎性反應控制后，在慢性炎癥過程中，利用MSC 在RA 環境下成骨、軟骨再生似乎成為可能。

綜上所述，MSC 對于滑膜浸潤和骨破壞有一定的治療作用，還具有免疫調節及多向分化的雙重作用，是RA 組織修復的理想種子細胞，可能彌補傳統DMARDs 類在治療RA 時的不足。今后研究方向將就MSC 的給藥方式、頻次和劑量等方面進行深入探討，為RA 的臨床治療提供新的方法。