不同介質對真姬菇菌種保藏效果的對比*

朱華玲，班立桐，黃 亮，王 玉，楊紅澎，孫 寧

（1.天津農學院基礎科學學院，天津 300384；2.天津農學院農學與資源環境學院，天津 300384）

真姬菇（Hypsizygus marmoreus)又名玉蕈、斑玉蕈、海鮮菇等，屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes） 傘菌目（Agaricales） 白蘑科（Tricholomataceae） 離褶菌科（Lyphyllaceae） 玉蕈屬（Hypsizygus），是一種優良的食用菌，其味比平菇鮮，肉比滑菇厚，質比香菇韌，口感極佳，是不可多得的食藥兼用的可工廠化生產的珍稀食用菌之一[1-5]，其產量僅次于金針菇與杏鮑菇，是食用菌市場的主力軍[6]。菌種是真姬菇生產中至關重要的生產資料，妥善保藏菌種的意義重大。選擇一種合適的保藏真姬菇菌種的介質，可提高菌種的品質和效益[7-12]。通過對比22種不同介質對真姬菇菌種的保藏效果，以期為真姬菇菌種的簡單有效保藏提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

真姬菇菌種HB-1斜面母種，由天津農學院食用菌研發中心提供；馬鈴薯淀粉與葡萄糖混合物（質量比 1∶4）；溴百里酚藍（bromothymol blue，BTB）；3-（4，5-二甲基-2-噻唑） -2，5-二苯基溴化四唑〔3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT〕，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）；瓊脂；磷酸二氫鉀；硫酸鎂；石膏；葡萄糖；NaCl；聚乙二醇；礦泉水；純凈水；超純水；蒸餾水；櫟木；楊木；腐木；麩皮。化學藥品均為分析純。

恒溫振蕩培養箱，上海精密儀器儀表公司；超凈工作臺，北京亞泰科隆儀器技術有限公司；紫外可見分光光度計，上海析譜儀器有限公司；水分測定儀，江蘇維科特儀器儀表有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫療器械有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 水溶液保藏

將蒸餾水、礦泉水、超純水、純凈水等在1×105Pa下高壓滅菌20 min。用滅菌后的蒸餾水配置不同濃度NaCl、葡萄糖和聚乙二醇溶液，經0.22 μm濾膜過濾除菌，濾液作為保藏水溶液，備用。用接種針將5個直徑為9 mm的真姬菇菌塊轉入已滅菌的5 mL凍存管中，移入3 mL～4 mL保藏水溶液，浸沒菌塊，密封，置于4℃冰箱中保藏，設置5個重復。

1.2.2 木屑保藏

按照參考文獻[13]將木屑過篩，僅保留1目～2目大小的木屑，用純水或浸泡鹽水（磷酸二氫鉀0.05%，硫酸鎂0.05%，pH 7.0） 進行浸泡預處理，處理好后裝瓶。裝瓶方法為將洗凈烘干在121℃下滅菌1 h后的錐形瓶冷卻后，先后裝入下層（純木屑）和上層（質量比為木屑∶麩皮∶石膏=39∶10∶1） 的保藏木屑，上下兩層木屑的質量比為1∶3，裝入下層木屑時需邊裝邊搖，使木屑盡量緊實；裝上層培養基時適度搖動，保證上下兩層分層明顯。錐形瓶裝好木屑后，密封，1×105Pa下高壓蒸汽滅菌2.5 h。待木屑溫度降至30°C以下時，在表面接入直徑為9 mm的真姬菇菌塊2塊，25°C下恒溫培養20 d。待木屑表面長滿菌絲后，置于4°C冰箱中保藏，設置5個重復。

1.2.3 斜面（對照） 保藏

制作普通PDA培養基，滅菌，擺斜面。接入一個直徑9 cm的真姬菇菌塊，25°C培養15 d后，置于4°C冰箱內進行保藏，設置5個重復。

1.3 保藏效果測定

1.3.1 菌絲生長速率測定

菌種分別保藏6個月和9個月后，在25°C下復蘇培養3 d。取一個直徑9 mm菌塊，轉接到PDA平板上，菌絲萌發后測量菌落直徑，25°C下培養48 h后測量菌落直徑，菌絲生長速率（v，cm·d-1）計算公式為：

式中：d1為菌絲萌發后菌落直徑（cm）；d2為25°C下培養48 h后菌落直徑（cm）。

1.3.2 菌絲脫氫酶活力測定

稱取從 1.3.1 中 PDA 平板上刮取的菌絲體 0.1 g，裝入15 mL離心管中，加入蒸餾水2 mL，5 mg·mL-1的MTT水溶液0.2 mL，35°C水浴避光靜置3 h。用注射器抽走液體，僅留菌絲，加入DMSO 2 mL，繼續35°C水浴避光靜置4 h。取上清液100 μL，以DMSO作空白，在490 nm波長處，測吸光度[14]。

1.4 檢測指標的差異性分析

采用軟件SPSS 22.0對試驗數據進行單因素方差分析（One-way ANOVA），使用Duncan檢驗方法，顯著水平設為P＜0.05[15]，考察不同保藏方法的菌絲生長速率、脫氫酶活性之間的相關性和差異性水平。

2 結果與分析

2.1 菌絲生長速率

采用不同介質對真姬菇菌種分別保藏6個月和9個月后，測定保藏菌種的菌絲生長速率，結果見表1。

表1 不同介質保藏菌種的平均菌絲生長速率Tab.1 Average mycelium growth rate of the strains preserved in different media

從表1可以看出，真姬菇菌種在不同介質中保藏6個月和9個月時后的菌絲的生長速率是各不相同的。保藏6個月時，菌絲生長速率最快的介質是0.6%葡萄糖溶液，其次是0.1%PEG6000，第三是0.9%NaCl溶液。除了PDA斜面保藏的菌種，其菌絲生長速率較低，僅為0.25 cm·d-1以外，其余保藏介質所保藏菌種的菌絲生長速率均較高，大于等于0.625 0 cm·d-1。對比NaCl溶液、葡萄糖溶液、PEG溶液、各種水以及木屑等保藏介質對真姬菇菌種進行6個月保藏后的菌絲生長速率發現，葡萄糖溶液的保藏效果最好，其次為PEG溶液，后面依次是各種水、氯化鈉溶液、保藏木屑和PDA斜面。保藏9個月時，菌絲生長速率最快的介質是礦泉水，其次是0.1%PEG10000，第三的是0.1%PEG和超純水，與PDA斜面相對比，0.9%NaCl、1.2%NaCl、1.0%葡萄糖溶液和4種木屑介質所保藏的菌種，其菌絲生長速率較低，均低于0.35 cm·d-1，其余保藏介質所保藏菌種的菌絲生長速率均較高。同樣對比NaCl溶液、葡萄糖溶液、PEG溶液、各種水和木屑等保藏介質對真姬菇菌種進行9個月保藏的菌絲生長速率發現，PEG溶液與各種水的保藏效果相當，是各介質中最好的，后面依次是葡萄糖溶液、氯化鈉溶液、PDA斜面和保藏木屑。

整體對比來看，菌種保藏6個月時的菌絲生長速率明顯高于保藏9個月的情況。綜合對比2個時段的菌絲生長速度來看，保藏效果比較好的3種介質依次是0.1%PEG10000、0.6%葡萄糖溶液和礦泉水，而保藏效果比較差的3種介質分別是PDA斜面、楊木+水和楊木+鹽水。

2.2 菌絲脫氫酶活力

采用不同介質對菌種分別保藏6個月和9個月后，測定保藏菌種的菌絲脫氫酶活力，結果見表2。

從表2可以看出，真姬菇菌種在不同介質中保藏6個月和9個月時后的菌絲脫氫酶活力是各不相同的。保藏6個月時的菌絲脫氫酶活力明顯好于菌種保藏9個月的情況。保藏6個月時，菌絲脫氫酶活力最高的介質是0.1%PEG6000，其次是純凈水和礦泉水，再次是0.1%PEG20000，除楊木+水介質外，其余介質所保藏菌種的菌絲脫氫酶活力均高于PDA斜面。從介質組成來看，各種水、PEG溶液、NaCl溶液和葡萄糖溶液所保藏菌種的菌絲脫氫酶活力依次降低，但均明顯好于保藏木屑和PDA斜面。保藏9個月時，菌絲脫氫酶活力最高的介質是0.1%PEG6000和0.8%葡萄糖溶液，其次是1.0%葡萄糖溶液和0.1%PEG10000，再次是純凈水。與PDA斜面相對比，0.3%NaCl溶液所保藏菌種的菌絲脫氫酶活力略低，其余保藏介質所保藏菌種的菌絲脫氫酶活力均高于PDA斜面。對比NaCl溶液、葡萄糖溶液、PEG溶液、各種水和保藏木屑等介質對真姬菇菌種進行9個月保藏后的菌絲脫氫酶活力發現，葡萄糖溶液的保藏效果最好，各種水的保藏效果略差，PEG溶液與保藏木屑的保藏效果相當，居第三，再后面依次是PDA斜面和氯化鈉溶液。

表2 不同介質保藏菌種的菌絲脫氫酶活力Tab.2 Average mycelium dehydrogenase activity of the strains preserved in different media

綜合對比2個時段的菌絲脫氫酶活力來看，保藏效果比較好的3種介質依次是0.1%PEG6000、1.0%葡萄糖溶液和純凈水。保藏效果比較差的3種介質依次是PDA斜面、櫟木+水和楊木+水。

2.3 保藏效果的綜合分析

為方便觀察分析，將22種保藏介質對真姬菇菌種進行保藏6個月和9個月的菌絲生長速度和菌絲脫氫酶活力進行了匯總和對比，結果見圖1。

由圖1可知，綜合考慮22種介質對真姬菇菌種保藏6個月和9個月的總體效果，不難看出，0.1%PEG6000溶液的總體保藏效果最好，其次是0.1%PEG10000溶液和超純水，再次是0.8%葡萄糖溶液和礦泉水。其他介質中也有保藏效果較好的，但僅在某個時段較好，例如0.6%葡萄糖溶液在保藏9個月時菌種擁有較好的菌絲生長速度和脫氫酶活力，但保藏6個月時菌絲生長速度較高，脫氫酶活力卻較低。再如用純凈水保藏6個月時真姬菇菌種擁有較好的菌絲生長速度和脫氫酶活力，但保藏9個月時菌絲脫氫酶活力較高，菌絲生長速度卻較低。

2.4 保藏效果評價指標參數的差異性分析

為評價采用的2種指標參數（菌絲生長速度與脫氫酶活力）在評價保藏效果的優劣性，進一步采用Duncan檢驗方法對表1、表2中6個月和9個月試驗數據分別進行了單因素方差分析，分別考察脫氫酶活力對菌絲生長速率的差異性水平，結果見表3。

表3 差異性分析數據表Tab.3 The data of difference analysis

如表3所示，顯示保藏6個月時脫氫酶活力對菌絲生長速率的顯著性結果分別為0.077；保藏9個月時脫氫酶活力對菌絲生長速率的顯著性結果分別為0.624；所有結果的保藏效果均大于0.05，表明無顯著差異。

3 結論與討論

采用22種不同保藏介質對真姬菇菌種進行6個月和9個月保藏試驗。結果表明，0.1%PEG6000溶液的總體保藏效果最好，其次是0.1%PEG10000溶液與超純水，再次是0.8%葡萄糖溶液和礦泉水。0.6%葡萄糖溶液僅適于真姬菇菌種9個月保藏，純凈水僅適于真姬菇菌種6個月保藏。其他介質的保藏效果略差。不同保藏介質能夠提供的環境和條件不同，也決定了不同保藏效果。本試驗中選用22種保藏介質中，有的含有少量營養物質，有的則僅提供水分，但各介質保藏效果卻沒有表現出營養物質含量越多，效果越好的特點，這可能與不同狀態菌絲對營養需求也不同有關。