急性髓細胞白血病患兒miR-126表達水平與預后的關系研究

容蓉 班奕 周肖瀅 王瀟娉 王小明

急性髓細胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）為一種異質性較強的血液系統惡性腫瘤，患者細胞對骨髓的侵襲抑制了紅系和巨核系造血祖細胞的增殖，出現貧血及血小板減少。因白血病（acute leukemia，AL）原始細胞形態學相似，單一骨髓細胞顯微鏡檢查診斷率約為80%，無法早期篩查及判斷預后，因此明確其發病機制是關鍵[1]。microRNA（miRNA，簡稱miR）參與細胞增殖、分化、凋亡、生長發育及腫瘤發生等眾多生物學過程，研究表明miRNA可通過調控耐藥相關基因或抑癌基因表達，而在腫瘤細胞化療敏感性方面發揮重要作用，早期有學者指出miR-181a在急性淋巴細胞白血病患兒、miRNA-125b在急性白血病中發揮作用[2-3]。而miR-126也是miRNA家族中的一員，研究顯示臍靜脈內皮細胞來源的顆粒攜帶miRNA-126可促進單核細胞遷移，微顆粒作為載體可攜帶miRNAs介導細胞間信號傳遞，但miRNA-126在兒童AML中的表達水平及其與預后的關系研究較少[4]。本文對miR-126表達水平及miR-126與預后的關系進行分析，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年5月至2016年12月本院收治的AML患兒58例，納入研究組，均符合《兒童急性髓細胞白血病診療建議》[5]中AML診斷標準，納入標準：①均首診為AML，經骨髓形態學、細胞組織化學染色、細胞免疫分型、細胞遺傳學及分子生物學檢測確診；②既往無腫瘤病史，年齡在14歲以下，確診后采用標準化誘導方案進行化療；③患兒監護人簽署相關知情同意書。排除標準：①治療相關性白血病、21三體綜合征相關性白血病、中樞神經系統白血病、急性早幼粒細胞白血病等；②合并其他腫瘤或未按標準完善相關檢查者。同時選取同期入院的非惡性病兒童（特發性血小板減少性紫癜、系統性紅斑狼瘡）30例為對照組，研究組中男31例，女27例；年齡2～13歲，平均年齡（7.45±1.11）歲，對照組中男16例，女14例；年齡1～13歲，平均年齡（7.42±1.15）歲，2組在性別、年齡等一般資料方面對比差異無統計學意義（P＞0.05）。依據出院時miR-126表達量相對水平將58例AML患兒分為高表達組、低表達組各29例，另根據《兒童急性髓細胞白血病診療建議》[5]將AML患兒分為臨床高危、中危、低危各16、20、22例，并依據預后情況分為完全緩解組、難治復發組、死亡組各18、26、14例，各亞組間一般資料比較差異也無統計學意義（P＞0.05）。本研究經我院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑/儀器

7300Real-time PCR儀購自美國Applied Biosystems公司，Power/PAC200水平電泳儀購自美國Bio-RAD公司，凝膠成像分析儀購自美國UVP公司。miRNA提取、探針、逆轉錄試劑盒與PCR擴增酶均購自美國Applied Biosystems公司；引物序列購自北京英俊生物技術有限責任公司。

1.2.1 miR-126表達水平測定

從標本庫中抽取其骨髓標本，采用TaqMan RT-PCR法檢測2組骨髓標本中miR-126的表達，進行總RNA抽提及miR-126特定的c DNA反轉錄，miR-126的提取依據試劑盒說明書進行操作，測定其濃度及OD260/280，在1.8～2.0者用于實時PCR檢測，濃度調整至2ng/μL，依據MicroRNA Assays說明書進行操作，選擇U 6作為內參照，引物 序 列：miR126：5′UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG3′，U6：5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′，均進行逆轉錄，轉錄條件：反應體系15μL[dNTP（100mM）0.15μL，逆轉錄酶（50U/μL）1.0μL，10×RTBuf fer1.5μL，RNA酶抑制劑（20U/μL）0.19μL，無RNA酶水4.16μL，RTmiR126/RT-U6探針3μL，RNA 5μL]，16℃30min；42℃30min；85℃5min；4℃，保持；反應產物于-20℃保存備用，依據產品說明書進行操作，PCR擴增總體系：20μL[TagMan擴增酶（20×）1μL，無RNA酶水7.67μL，TagMan2×Universal PCRMaster Mix（No Amp Erase UNG 10.0μL，逆轉錄產物1.33μL]，50℃2min；19℃10min，95℃15s，60℃1min，循環40個，依據CT值，分析以β-action、U6為內參照，利用Ct值計算各組miR-126表達相對量，相對量=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=ΔCt（試驗樣本）-ΔCt（校準樣本），ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（β-action），基因表達差異的倍數即2-ΔΔCt。

1.2.2 AML治療方案

以柔紅霉素（daunorubicin，DNR）、阿糖胞苷（cytarabine，Ara-C）[DA，3+7方案]或DNR、Ara-C聯合依托泊苷（etoposide，VP16）[DAV，3+7+3方案]進行治療，具體為：①DA方案：DNR 30mg/（m2·d），第（1～3天）；Ara-C100～200mg/（m2·d），第（1～7天）；②DAV方案：DNR、Ara-C同上，另聯合VP16100mg/（m2·d），第（5～7天）。待患兒獲得骨髓緩解后，繼續按原方案完成2療程鞏固治療；鞏固治療后，完成5～6次大劑量Ara-C為主的強化治療，前3次連續應用，后3次與標準劑量Ara-C交替應用。總療程9～12個月。

1.2.3 隨訪及預后判斷

均完成1年隨訪，完全緩解（complete remission，CR）[6]：誘導緩解治療后第8復查骨髓達緩解標準，且持續3個月以上未見異常。難治復發性AML標準[7]：①標準方案誘導化療2個療程未獲得CR；②第一次CR后6個月內復發；③第一次CR后6個月內復發、經原方案再誘導化療失敗；④2次或2次以上復發；⑤髓外白血病持續存在。

1.3 觀察指標

①比較研究組（分為高危、中危、低危）、對照組入院時骨髓標本中miR-126表達量；②依據出院時miR-126表達量相對水平將58例AML患兒分為高表達組、低表達組各29例，比較2組miR-126表達量及中位生存時間、無事件生存時間、中位生存率，中位生存時間：自診斷起至死亡或末次隨訪時間，無事件生存時間：診斷至第一次事故發生或末次隨訪時間，事故包括復發、死亡與失訪；③依據1年內隨訪結果將其分為完全緩解組、難治復發組、死亡組，比較3組入院時、出院時、末次隨訪時miR-126表達量；④分析AML患兒miR-126表達水平與其預后的關系。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件處理數據，計數資料以%表示，采取χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，行t檢驗，高危、中危、低危患兒miR-126表達量及完全緩解組、難治復發組不同時點miR-126表達水平采用重復測量數據的方差分析（F檢驗），相關分析采用Spearman相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究組、對照組骨髓標本中miR-126表達量

研究組骨髓標本中miR-126表達量明顯高于對照組（P＜0.05）；研究組中，高危患兒miR-126表達量高于中危、低危患兒，中危、低危患兒miR-126表達量比較差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

2.2 miR-126高表達組、低表達組miR-126表達量及預后情況比較

出院時miR-126高表達組miR-126表達量高于miR-126低表達組，而中位生存時間、無事件生存時間、中位生存率短/低于低表達組（P＜0.05）（表2）。

表1 研究組、對照組骨髓標本中miR-126表達量比較Table1 Comparison ofmiR-126 expression in bonemarrowsamples of study group and controlgroup

2.3 完全緩解組、難治復發組、死亡組患者miR-126表達水平比較

3組出院時、末次隨訪時miR-126表達水平均明顯低于同組入院時，且完全緩解組出院時、末次隨訪時miR-126表達水平較難治復發組、死亡組低，難治復發組、死亡組miR-126表達水平差異也有統計學意義（P＜0.05）（表3）。

表2 miR-126高表達組、低表達組miR-126表達量及預后情況比較[n=29，（%）]Table2 Comparison ofmiR-126 expression and prognosis inmiR-126 high expression group and lowexpression group[n=29，（%）]

表3 完全緩解組、難治復發組、死亡組患者miR-126表達水平比較[n，（±s）]Table3 Comparison ofmiR-126 expression in complete remission group and refractory recurrence group[n，（±s）]

表3 完全緩解組、難治復發組、死亡組患者miR-126表達水平比較[n，（±s）]Table3 Comparison ofmiR-126 expression in complete remission group and refractory recurrence group[n，（±s）]

注：與同組入院時比較，aP＜0.05；與完全緩解組比較，bP＜0.05；與難治復發組比較，cP＜0.05。

組別完全緩解組（n=18）難治復發組（n=26）死亡組（n=14）F值P值入院時1.78±0.111.75±0.09 1.78±0.08 F交互=18.976，F組間=7.865，F時點=11.329 P交互=0.000，P組間=0.004，P時點=0.000出院時1.34±0.25a 1.54±0.20ab 1.67±0.17abc 末次隨訪時1.12±0.13a 1.24±0.21ab 1.41±0.15abc

2.4 AML患兒miR-216表達水平與其預后的關系分析

相關性分析結果顯示，AML患兒入院時miR-216表達水平與其中位生存時間、無事件生存時間、中位生存率呈負相關（P＜0.05）（表4）。

表4 AML患兒miR-216表達水平與其預后的關系分析Table4 The relationship betweenmiR-216 expression and prognosis in children with AML

3 討論

兒童AML可發生在任何年齡，無明顯性別差異。國際法美英（French，American and British，FAB）協作組根據形態學將其分為M0～M7共8種亞型，其中M3（急性早幼粒細胞白血病，acute promyelocytic leukemia，APL）是較特殊類型的AML[8]。隨著化療藥物發展，APL成為可以治愈的惡性白血病，但超過1/3的非APL的AML患兒預后不良，因此分析疾病相關特征及與患兒預后的關系是兒科醫師重點課題[9-10]。miRNA為一類長度為19～25個核苷酸的內源性非編碼小RNA，在基因網絡系統中發揮主要的“調控節點”作用，可在轉錄或轉錄后水平調節基因的表達，以抑制翻譯或降解蛋白質[11]。近年來miRNA在血液系統疾病造血鏈分化中的作用及癌基因與抑癌基因的雙重作用受到重視[12]。miR-126為位于9q34.3的內皮細胞特異性miRNA，可通過靶基因介導血管內皮細胞對內皮細胞生長因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）的反應，在血管生成過程中發揮重要作用。張艷等[13]的研究結果顯示成人AML患者骨髓中miR-126相對表達水平較正常人群增高，尤其在M3型AML患者中表達水平明顯低于非M3型，可用于區分AML亞型。但目前關于miR-126在兒童中的表達水平及其與預后的關系研究較少。

Li等[14]的研究結果顯示，miRNA-126與其反義鏈miRNA-126*在伴有t（8；21）與inv（16）染色體易位的AML中特征性過表達，在t（15；17）染色體變異的AML中，miRNA-126及miRNA-126*則下調。Li的進一步研究結果顯示，miRNA-126與AML1/ETO融合基因協同抑制AML細胞凋亡，提高細胞活力，此外miRNA-126可通過負向調控PLK2基因，繼而抑制AML惡性細胞凋亡，并促進其增殖。可見miR-126在AML中發生發展中起著重要作用，但其與預后的關系研究較少涉及。本次研究也表明AML患兒miR-126呈高表達狀態，且隨患兒臨床危重程度增加，miR-126表達量升高。可能是因為，經剪切修飾的成熟miR-126進入RNA誘導的沉默復合物中，經結合靶mRNA的3′端非翻譯區抑制靶mRNA表達，通過抑制翻譯或降解靶mRNA的機制以實現相關調節，且隨著臨床病情加重這種機制更為明顯[15]。在與預后的關系方面，本研究結果顯示，出院時miR-126高表達組中位生存時間、無事件生存時間、中位生存率短/低于miR-126低表達組，表明出院時miR-126水平可較好預測AML患兒預后，低水平miR-126預示著預后更良好，這與Shibayama等[16]通過研究得出的microRNA-126-5p上調與阿糖胞苷耐藥性和不良預后有關的結果相近。但因條件限制，本研究預后評估方面未涉及AML患兒阿糖胞苷的耐藥性，且未對miR-126高表達預測不良預后的機制進一步進行分析，因此可將其作為后期進一步研究內容。本研究也顯示，在出院時及隨訪中，完全緩解組miR-126表達水平均低于難治復發組、死亡組，難治復發組、死亡組miR-126表達水平差異也有統計學意義，且相關性分析結果也初步證實AML患兒miR-126表達水平與其預后存在一定關系，這與Li等[17]通過研究得出的AML患者miR-126高表達與不良生存率有明顯相關性的結果一致。考慮是因為miR-126通過靶基因介導血管內皮細胞對內皮細胞生長的反應作用，使血管生成增多，因此miR-126水平高低可反映AML患兒病情并預測其預后水平與化療療效[18-19]，對miR-126的深入研究將會揭示AML新的發病機制，為其診斷提供新的分子標志物，為AML的治療提供新思路。

綜上所述，AML患兒miR-126表達水平與其預后密切相關，miR-126表達水平可預測遠期預后，因此可將其作為臨床治療靶點及預后監測指標。