miR-219a-5p對皮膚鱗狀細胞癌細胞凋亡的影響及機制

林永麗 楊燦 李艷

皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）是常見的皮膚惡性腫瘤之一。目前的治療方式還是以手術為主，放化療為輔[1]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼RNA，可通過調控靶基因的表達影響細胞增殖、分化和凋亡等生命過程[2]。據報道miRNA參與了皮膚腫瘤的發生發展，研究miRNA對在其中的作用機制，有利于皮膚腫瘤診斷和治療[3]。miR-219a-5p可抑制乳腺癌細胞遷移和上皮-間質轉化[4]；miR-219a-5p可抑制惡性黑素瘤的生長和轉移[5]。染色質結構維持蛋白4（structuralmaintenance of chromosome 4，SMC4）是SMC家族成員之一，主要參與染色體高級結構動態變化，與腫瘤的發生過程有關[6]。干擾SMC4表達可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力[7]。Wnt信號通路是一種基礎信號通路，調控細胞增殖、分化，影響細胞凋亡[8]；Wnt/βcatenin是Wnt中重要的信號調節通路，參與多種人類腫瘤的發生發展[9]。Wnt/β-catenin信號通路的異常激活可導致鼻咽癌的發生發展[10]；miR-200a抑制Wnt/β-catenin通路可以緩解腎間質纖維化[11]。但miR-219a-5p對CSCC增殖、凋亡的影響及其機制是否與SMC4、Wnt/β-catenin通路有關還尚未清楚，本實驗旨在研究miR-219a-5p對CSCC增殖、凋亡的影響以及miR-219a-5p是否通過調控SMC4、Wnt/βcatenin信號通路影響CSCC的增殖和凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料

皮膚鱗狀細胞癌細胞HSC-2、Colo-16、SCL-1和人正常皮膚細胞HaCaT均購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、RPMI-1640培養基購自美國Sigma公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；MTT試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司?？贵w均購自上海煊翎生物科技有限公司。FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司；ThermoFC酶標儀購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

皮膚鱗狀細胞癌細胞HSC-2、Colo-16、SCL-1和人正常皮膚細胞HaCaT用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養，每天換液一次，待細胞融合至80%左右時，加入0.25%的胰蛋白酶進行消化傳代，選取處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞轉染與分組

取對數生長期細胞HSC-2，用無血清培養基同步化12h后，將miR-con、miR-219a-5p、anti-miR-con和anti-miR-219a-5p分別轉染至細胞HSC-2中，記為miR-con組、miR-219a-5p組、anti-miR-con組和antimiR-219a-5p組；未進行任何處理的細胞HSC-2作為空白對照組（NC）；將miR-219a-5p分別與pcDNA和pcDNA-SMC4共同轉染至細胞HSC-2中，記為miR-219a-5p+pcDNA組和miR-219a-5p+pcDNASMC4組，轉染均按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作，均轉染培養48 h，每組實驗重復3次。

1.2.3 qRT-PCR檢測miR-219a-5p和SMC4mRNA表達水平

收集以上培養48 h后的各組細胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用Ta Ka Ra反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，按照Ta Ka Ra熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系，以β-actin為內參進行PCR擴增，每個樣品重復3次，循環條件為95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，共40個循環；72℃延伸5min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.2.4 Westernblot檢測SMC4、CyclinD1、Caspase-3、Wnt2、β-catenin蛋白的表達

收集以上培養48 h后的各組細胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，12000g離心15min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1h。分別加入一抗（1∶1000），4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗（1∶2000）室溫孵育2h，TBST洗滌3次，每次10min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達水平。實驗重復3次。

1.2.5 MTT檢測細胞活性

各組細胞培養至48h時加入20μL的MTT溶液，繼續孵育4 h；棄去多余培養基并加入150μL DMSO振蕩反應10min，酶標儀檢測490nm處吸光度（OD）值。細胞存活率（%）=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

用不含EDTA的胰酶消化培養48 h后的各組細胞后離心收集，PBS漂洗2次，加結合緩沖液重懸細胞。依據試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育15min。流式細胞儀檢測激發波長488nm和發射波長530nm處的熒光強度。實驗重復3次。

1.2.7 熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-219a-5p對SMC4的靶向調控

TargetScan數據庫顯示SMC43′UTR區域有miR-219a-5p結合位點。構建野生型和突變型基因靶點SMC4的3′UTR熒光素酶表達載體（SMC4-WT和SMC4-MT），將SMC4-WT和SMC4-MT載體質粒分別與miR-con和miR-219a-5p共轉染至HSC-2細胞中，具體轉染步驟按LipofectamineTM2000試劑盒說明進行實驗重復3次。

1.2.8 統計學分析

采用SPSS 20.0進行統計學分析。計數資料用%表示，計量資料以（±s）表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-219a-5p和SMC4在皮膚鱗狀細胞癌細胞株中的表達

與人正常皮膚細胞HaCaT相比，皮膚鱗狀細胞癌細胞HSC-2、Colo-16、SCL-1中miR-219a-5p的表達水平顯著降低，SMC4mRNA和蛋白的表達水平顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖1，表1）。

圖1 皮膚鱗狀細胞癌細胞株中SMC4蛋白表達結果Figure1 Expression of SMC4 protein in skin squamous cell carcinoma cell lines

表1 皮膚鱗狀細胞癌細胞株中miR-219a-5p和SMC4的表達[n=9，（±s）]Table1 Expression ofmiR-219a-5p and SMC4 in squamous cell carcinoma cell lines[n=9，（±s）]

表1 皮膚鱗狀細胞癌細胞株中miR-219a-5p和SMC4的表達[n=9，（±s）]Table1 Expression ofmiR-219a-5p and SMC4 in squamous cell carcinoma cell lines[n=9，（±s）]

注：與HaCaT組比較，aP＜0.05，aP＜0.05vs HaCaT group。

分組HaCaT HSC-2 Colo-16 SCL-1 F值P值miR-219a-5p 1.00±0.080.35±0.05a 0.25±0.09a 0.41±0.11a 141.4740.000SMC4mRNA 1.00±0.031.86±0.09a 2.05±0.12a 1.73±0.13a 188.3670.000SMC4 protein 1.00±0.072.15±0.12a 2.23±0.14a 2.03±0.14a 202.9280.000

2.2 轉染miR-219a-5p誘導皮膚鱗狀細胞癌細胞的凋亡

與miR-con組相比，miR-219a-5p組皮膚鱗狀細胞癌中miR-219a-5p的表達水平顯著升高，Cyclin D1表達水平顯著降低，Caspase-3表達水平顯著升高，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）（表2）。

2.3 miR-219a-5p過表達對Wnt/β-catenin信號通路的影響

與miR-con組相比，miR-219a-5p組皮膚鱗狀細胞癌中Wnt2、β-catenin表達水平顯著降低，GSK3β表達水平顯著升高（P＜0.05）（表3）。

表2 轉染miR-219a-5p對皮膚鱗狀細胞癌HSC-2細胞中miR-219a-5p、CyclinD1、Caspase-3的表達量和凋亡的影響[n=9，（±s）]Table2 Effect of transfection ofmiR-219a-5p on expression ofmiR-219a-5p，CyclinD1，Caspase-3and apoptosis in squamous cell carcinoma HSC-2 cells[n=9，（±s）]

表2 轉染miR-219a-5p對皮膚鱗狀細胞癌HSC-2細胞中miR-219a-5p、CyclinD1、Caspase-3的表達量和凋亡的影響[n=9，（±s）]Table2 Effect of transfection ofmiR-219a-5p on expression ofmiR-219a-5p，CyclinD1，Caspase-3and apoptosis in squamous cell carcinoma HSC-2 cells[n=9，（±s）]

分組NC miR-con miR-219a-5p F值P值miR-219a-5p 1.00±0.050.92±0.09 3.35±0.34a 407.7030.000細胞存活率99.56±4.3689.85±4.0251.86±3.25a 375.1740.000凋亡率4.56±1.356.25±1.48 28.46±1.94a 617.6400.000CyclinD11.00±0.060.85±0.090.35±0.12a 119.8280.000Caspase-31.00±0.08 1.21±0.112.97±0.37203.3570.000

表3 轉染miR-130a-3p對皮膚鱗狀細胞癌HSC-2細胞對Wnt/β-catenin信號通路的影響[n=9，（x±s）]Table3 Effect of transfection ofmiR-130a-3p onWnt/βcatenin signaling pathway in squamous cell carcinoma HSC-2 cells[n=9，（±s）]

表3 轉染miR-130a-3p對皮膚鱗狀細胞癌HSC-2細胞對Wnt/β-catenin信號通路的影響[n=9，（x±s）]Table3 Effect of transfection ofmiR-130a-3p onWnt/βcatenin signaling pathway in squamous cell carcinoma HSC-2 cells[n=9，（±s）]

注：與miR-con組比較，aP＜0.05，aP＜0.05vs miR-con group。

分組NC miR-con miR-219a-5p F值P值miR-219a-5p 1.00±0.030.99±0.075.78±0.58a 602.1820.000Wnt21.00±0.050.88±0.090.34±0.06a 235.0140.000β-catenin 1.00±0.070.95±0.090.42±0.13a 93.2810.000GSK3β 1.00±0.041.05±0.09 2.54±0.21a 384.2730.000

2.4 miR-219a-5p靶向SMC4抑制SMC4蛋白的表達

TargetScan數據庫預測到SMC4與miR-219a-5p存在結合位點（圖4A）。熒光素酶報告基因檢測實驗結果（表4）顯示，相較于miR-con組，miR-219a-5p組SMC4-WT細胞HSC-2的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而SMC4-MT細胞HSC-2的熒光素酶活性差異不顯著。Western Blot檢測結果（圖4 B）顯示，相較于miR-con組，miR-219a-5p組HSC-2細胞中SMC4表達水平顯著降低；相較于anti-miR-con組，anti-miR-219a-5p組HSC-2細胞中SMC4表達水平顯著升高（P＜0.05）。

圖4 miR-219a-5p靶向SMC4的蛋白表達結果Figure4 miR-219a-5p targets SMC4

表4 miR-con或miR-219a-5p與報告質粒共轉染皮膚鱗狀細胞癌HSC-2細胞后雙熒光素酶活性檢測（n=9）Table4 Detection of dual luciferase activity after co-transfection of skin squamous cell carcinoma HSC-2 cellswithmiR-con ormiR-219a-5p and reporter plasmid（n=9）

2.5 過表達SMC4逆轉miR-219a-5p誘導皮膚鱗狀細胞癌的凋亡

與miR-con組相比，miR-219a-5p組SMC4、Cyclin D1表達水平顯著降低，Caspase-3表達水平顯著升高，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與miR-219a-5p+pcDNA組相比，miR-219a-5p+pcDNA-SMC4組SMC4、CyclinD1表達水平顯著升高，Caspase-3表達水平顯著降低，細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）見表5，圖5。

表5 Wes ternblot檢測皮膚鱗狀細胞癌HSC-2細胞中SMC4的蛋白表達（n=9）Table5 Western blotanalysis of SMC4 protein expression in skin squamous cell carcinoma HSC-2 cells（n=9）

圖5 Wes ternblot檢測皮膚鱗狀細胞癌HSC-2細胞中SMC4、CyclinD1和Caspase-3的表達Figure5 Western blotanalysis of SMC4,CyclinD1and Caspase-3expression in skin squamous cell carcinoma HSC-2 cells

3 討論

CSCC發病率逐年上升，且易轉移，對人類生命健康威脅極大[12]。miRNA在多種惡性腫瘤發生發展中發揮重要作用[13]。研究發現miR-219-5p可抑制非小細胞肺癌的增殖和侵襲并促進其凋亡[14]。miR-219-5p過表達通過上調Cleaved Caspase-3蛋白表達可抑制胰腺癌細胞增殖和侵襲，并誘導細胞凋亡[15]。本研究結果表明，miR-219a-5p在CSCC細胞系中均低表達，過表達miR-219a-5p可抑制CSCC細胞增殖，誘導細胞凋亡；促進Caspase-3表達，抑制CyclinD1表達。

SMC4屬于SMC染色體ATP酶家族，SMC4在肺腺癌組織中過表達，敲低SMC4顯著抑制A549細胞的增殖和侵襲[16]。SMC4的過表達可激活TGFβ/Smad信號傳導并促進膠質瘤細胞的侵襲[17]；SMC4在肝癌細胞中上調表達，miR-219可降低SMC4的表達，而SMC4又下調JAK2/Stat3的表達[18]。本研究中SMC4在CSCC中也上調表達，且miR-219a-5p也調控SMC 4的表達，過表達SMC4還能逆轉miR-219a-5p對細胞HSC-2的增殖抑制和凋亡促進的作用。

研究發現Wnt/β-cat enin信號通路可與miRNA相互作用、調控進而影響腫瘤的發生發展。有研究報道miR-219-5p通過靶向LRH-1/Wnt/β-catenin信號通路可抑制胃癌細胞的增殖，遷移和侵襲[19]；miR-219-5p通過靶向Twist/Wnt/β-catenin信號通路也能抑制上皮性卵巢癌細胞的增殖，遷移和侵襲[20]；此外Sox9介導Wnt/β-catenin信號通路還影響皮膚鱗癌細胞的增殖[21]。本實驗結果表明，miR-219a-5p過表達會抑制CSCC中Wnt2、β-catenin和Cyclin D1蛋白表達，Cyclin D1又是Wnt/β-catenin通路下游調控因子，即miR-219a-5p過表達會抑制Wnt/β-catenin信號通路，提示miR-219a-5p過表達影響CSCC細胞增殖、凋亡可能與Wnt/β-catenin信號通路有關。

綜上所述，miR-219a-5p抑制皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，其機制可能與SMC4及Wnt/β-catenin信號通路有關，將可為皮膚鱗狀細胞癌的預防和治療提供新思路和新靶點。