廣州市地區7234例新生兒耳聾基因突變分析

李瑪葉燕綢 何國煒 董慧敏 李林 胡波 章鈞*

我國每年約有2000萬新生兒出生，新生兒先天性耳聾的發生率在0.93%～7.7%不等[1]，新生兒中耳聾基因攜帶率達4.70%[2]。我國耳聾出生缺陷嚴峻，每年約有4萬聾兒出生，導致耳聾的因素很復雜，包括遺傳因素、環境因素等。環境因素導致的耳聾隨著社會的發展和國民保健水平的提高得到了很大的改善。遺傳因素逐漸成為耳聾患兒出生的主要原因，流行病學研究發現中國人群的耳聾主要由GJB2、SLC26A4、線粒體12S rRNA等基因突變引起，但不同的地區熱點突變存在差異[3-4]。本研究采用微陣列基因芯片技術，對本院新出生的7234名新生兒開展GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12SrRNA的4個基因9個熱點的耳聾基因檢測，并對266例攜帶者進行位點驗證及基因外顯子測序，為基因突變攜帶者或患者提供監控預防指導以及父母再生育的遺傳咨詢，對其他位點的挖掘以期建立一套適合本地區的篩查及診斷方案。

1 材料與方法

1.1 標本采集與DNA提取

經患者知情同意后，采集本院產科2015年6月至2019年1月分娩分娩的7234例新生兒臍帶血2 mL，EDTA.K2抗凝劑抗凝。使用DNA提取試劑盒按說明書進行DNA提取，測定DNA樣本的OD260nm/OD280nm比值應在1.6～2.0之間，OD260nm/OD230nm比值需≥2.0，-20℃保存備用。

1.2 試劑與儀器

DNA提取試劑盒：Qiamp mini kit，Qiagen（德國，貨號：51306）基因檢測試劑盒：晶芯?九項遺傳性耳聾基因檢測芯片試劑盒，博奧生物有限公司（北京，貨號：300065）PCRmastermix試劑盒：Takara（日本，貨號：9152A）；離心機：Eppendorf，（5424R德國）；PCR擴增儀：ABI9700（美國）；芯片雜交儀：晶芯BioMixer II（博奧生物有限公司，北京）；芯片掃描儀：晶芯?LuxScanTM10K-B（博奧生物有限公司，北京）。

1.3 耳聾芯片檢測與結果解讀

采用晶芯?九項遺傳性耳聾基因檢測芯片試劑盒檢測與分析常見的9個非綜合征型耳聾基因突變熱點。簡明操作流程為PCR反應、雜交與洗片、芯片掃描判讀。芯片雜交結果經掃描后在同位點中探針W出現陽性信號，判讀為該位點野生型；M出現陽性信號，判讀為該位點純合突變型；兩者均出現陽性信號，判讀為該位點雜合突變型。對于線粒體12S rRNA基因突變位點，M出現陽性信號判讀為同質突變，兩者均出現陽性信號判讀為異質突變。

1.4 PCR測序驗證

根據基因芯片掃描檢出的陽性突變位點分別進行PCR擴增驗證。PCR引物采用Primer 3.0在線引物設計軟件設計并由上海生物工程公司合成，引物序列、退火溫度及擴增片段長度，見表1。PCR反應體系采用PCRmastermix試劑盒按說明書進行擴增，產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化測序，測序結果使用chromas軟件（Technelysium，Australia）分析。

表1 引物列表Table1 GJB2、SLC26A4、Mitochondria 12 SRNA Primers list

2 結果

2.1 耳聾基因芯片檢測結果

7234 名普通新生兒中篩查出基因突變數為266，人群攜帶率為3.68%（266/7234）。GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12S rRNA基因攜帶率見表2。GJB2c.235del C、SLC26A4IVS7-2 A＞G、GJB2c.299 del AT、線 粒 體12S rRNA 1555A＞G、SLC26A4：c.2168 A＞G、GJB3c.538 C＞T、GJB2c.176 del 16 1.9%、GJB2c.35del G和線粒體12S rRNA 1494 C＞T各突變頻率，見表3。

表2 7234例樣本中4個突變基因的人群攜帶率[n（%）]Table2 The carrier rate andmutation spectrum of genes in 7234 newborns[n（%）]

表3 9個突變位點突變頻率比較[n（%）]Table3 Comparison of mutation frequencies in 9 mutations[n（%）]

2.2 DNA測序驗證

基因芯片篩查出基因突變數為266例，且9個突變位點均出現陽性病例，在相應基因外顯子測序驗證過程中發現，基因芯片篩查出的突變位點與測序結果全部符合。2名新生兒發現同一新的位點突變，即基因芯片檢測為GJB2c.235del C雜合突變，測序結果為GJB2c.235delC與c.109G＞A雙重雜合突變。病例1中GJB2c.109G＞A雜合突變，遺傳來源母親；GJB2c.235del C雜合突變，遺傳來源父親，見圖1。病例2中GJB2c.109G＞A雜合突變，遺傳來源父親；GJB2c.235del C雜合突變，遺傳來源母親。病例3基因芯片檢測為SLC26A4IVS 7-2A＞G雜合突變，測序結果為SLC26A4 IVS7-2A＞G與c.1983C＞A雙重雜合突變，見圖2。該新生兒SLC26A4IVS7-2 A＞G雜合突變，遺傳來源母親；SLC26A4c.1983C＞A雜合突變，遺傳來源父親。

圖1 病例1GJB2基因外顯子測序結果Figure1 GJB2 coding sequencing result in patient1

3 討論

耳聾是人類最常見的感覺神經系統障礙，根據2006年第二次全國殘疾人抽樣調查，推算出我國有聽力殘疾2004萬人，占殘疾人總數的24.16%，其中6～14歲的聽力障礙兒童達11萬[5-6]。耳聾已經嚴重影響了我國的人口素質，增加了國民經濟、醫療負擔，粗略估計大約有50%的學語前聽力障礙都是由遺傳因素引起[7]。GJB2是導致遺傳性非綜合征型耳聾最常見的基因，21%先天性耳聾患者與該基因有關[8]，其次為SLC26A4基因14.5%，再次為導致藥物中毒性耳聾的線粒體12SrRNA基因突變4.0%[9]及GJB3基因突變等。本次研究中發現GJB2基因的突變攜帶率為2.2%（159/7234），占基因突變數的59.8%（159/266），c.235delC雜合突變占GJB 2基因突變的83%（132/159），突變頻率最高。研究數據與其他學者的研究結果GJB2基因陽性率2.6%～3.2%，c.235delC雜合突變占GJB2基因突變54.9%～76.2%接近[10-12]，其次c.299del AT雜合突變13.4%。對攜帶者進行外顯子測序驗證中發現2名攜帶GJB2c.235del C新生兒同時攜帶GJB2c.109G＞GA雜合突變，該突變位點被臨床變異位點數據庫（ClinVar）、人類基因突變數據庫（Human Gene Mutation Database，HGMD）及耳聾變異位點數據庫（Deafness Variation Database，DVD）數據庫中收錄，依據美國醫學遺傳學與基因組學學會（The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）遺傳變異分類標準與指南評分[13]，該變異被分類為“可能致病性”。GJB2導致的非綜合征型耳聾為常染色體隱性遺傳病，可能致病位點的純合突變或者復合雜合突變可引起非綜合征型耳聾。兩名新生兒電生理耳聾篩查表現為耳聲發射和自動聽性腦干反應聽力篩查未通過，結合耳聾基因檢測結果，兩名新生兒為先天性聾兒。因此，將對這2例新生兒進行病例隨訪，以進一步分析GJB2c.109 G＞A在廣州市的致聾性，為廣州市下一步開展耳聾基因篩查是否增加GJB2c.109G＞A做出指導。

SLC26A4基因突變與Pendred綜合征（前庭導水管擴大或伴內耳畸形、神經性聾和甲狀腺腫）和單純前庭導水管擴大和（或）內耳畸形有密切關系[14-15]。東亞人群中最常見的是外顯子8上游的IVS 7-2 A＞G和外顯子19的c.2168A＞G突變類型[16]。本次研究中發現SLC26A4基因的突變攜帶率為1.18%（85/7234），與王秋菊等[17]在460例新生兒中篩查的SLC26A4致病基因攜帶率1.13%基本一致，占基因突變數的32.0%（85/266）。對攜帶者進行外顯子測序驗證中發現1名患兒攜帶SLC26A4：IVS7-2 A＞G同時攜帶c.19 8 3C＞A雜合突變。SLC26A4c.1983C＞A在ClinVar、HGMD、DVD數據庫中收錄，ACMG遺傳變異分類標準與指南評分，該變異被分類為“可能致病性”，導致的非綜合征型耳聾為常染色體隱性遺傳病，可能致病位點的純合突變或者復合雜合突變可引起大前廳導水管綜合征。臨床上早期發現該基因突變患者，結合影像資料，可以通過醫生的指導、嚴格的活動限制和密切的觀察來保存患者的殘存聽力，避免引起顱內壓變化的因素，例如感冒發熱、不健康的生活方式及頭部撞擊或外傷等[18]。因此，SLC26A4基因的檢測，對于預防該基因引起的耳聾和耳聾的惡化有很重要的意義。

GJB3基因突變可導致常染色體隱性遺傳性耳聾和常染色體顯性遺傳性耳聾[19]。GJB3c.538C＞T雜合突變攜帶者臨床可表現為遲發型高頻聽力下降[20]。本次研究中GJB3基因突變的攜帶率為0.1%（8/7234），占基因突變數的3.0%（8/266），建議攜帶者定期監測聽力功能，盡早發現和干預聽力功能下降的問題。

大量研究證實，線粒體的突變與耳聾密切相關，確定的與藥物性耳聾關系密切的突變是線粒體12SrRNA1555A＞G和1494C＞T[21-23]，突變的個體對氨基糖甙類抗生素耳毒性具有高度的敏感性。由于線粒體的基因突變引起的感音神經性耳聾可以出現在嬰幼兒，少年或成年期，且應用單次劑量即可導致攜帶此突變個體的重度聽力損失，不可逆轉，必須盡量避免使用氨基糖苷類抗生素。

廣州市天河區單一醫院新生兒耳聾基因人群攜帶率為3.68%，與中國人群的攜帶率基本一致[24]，新生兒耳聾基因篩查可以有效的篩查出人群中的基因攜帶者。耳聾基因篩查能夠從分子水平發現可能存在聽力障礙的新生兒，基因攜帶的情況下繼續進行基因檢測，能有效發現患兒，為耳聾兒童的早期發現與早期干預提供參考與指導，也可為患兒父母的再生育提供優生優育指導。