屏南縣羊口瘡病的診斷和PCR流行病學調查

陸李枝

摘?要：羊口瘡病是屏南縣羊養殖過程中常見的疾病之一，制約了屏南縣養羊產業的健康發展。為了確定屏南縣臨床羊口瘡病的病原以及了解該病在屏南縣的流行情況，為該病的科學防治提供依據。采用PCR方法檢測了12份縣域內臨床羊口瘡病的病原，并隨機采集了縣域內6家規模養羊場（戶）217份羊只血樣進行羊口瘡病的流行病學調查。結果表明：12份病例的病變組織、血樣提取的病毒基因組DNA樣品均擴增出約500 bp片段，與預期片段大小一致，明確了引起屏南縣臨床羊口瘡病的病原為羊口瘡病毒（ORFV）;屏南縣6家規模養羊場（戶）的羊口瘡病毒（ORFV）感染率為14.63%～33.33%，平均感染率為25.99%;抽樣調查的群體中有羊口瘡臨床病癥的羊只均為1～3月齡羔羊，各養殖場臨床發病率為0～16.33%，平均發病率為9.69%，低于羊群羊口瘡病毒（ORFV）感染率。

關鍵詞：羊口瘡;流行病學;PCR診斷;屏南縣

中圖分類號：S826?文獻標志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）01-0046-04

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.01.008

Diagnosis and PCR Epidemiological Investigation of Sore Mouth Disease in Pingnan County

LU Li?zhi

（Pingcheng Town Animal Husbandry and Veterinary Station of Pingnan County， Ningde， Fujian 352399， China）

Abstract： The sore mouth disease is one of the common diseases in sheep breeding in Pingnan County， which has restricted the healthy development of sheep breeding industry in Pingnan County. By determining the pathogen of clinical sore mouth disease in Pingnan County and understanding the prevalence of the disease in Pingnan County， it would provide a basis for the scientific prevention and treatment of the disease. PCR was used to detect the pathogens of 12 cases of clinical sore mouth disease in the county， and a total of 217 sheep blood samples were randomly collected from 6 large?scale sheep farms （households） in the county for epidemiological investigation. The results showed that the DNA samples of viral genome extracted from the pathological tissue and blood samples of the 12 cases were amplified to approximately 500 bp fragments， which were consistent with the expected fragment size， so it was identified that the pathogen causing clinical sore mouth disease in Pingnan County was ORFV. The infection rate of ORFV in 6 large?scale sheep farms （households） in Pingnan County was 14.63%-33.33%， with an average infection rate of 25.99%. Among the sampled groups， all the sheep with clinical symptoms of sore mouth disease were 1-3 month?old lambs， and the clinical incidence rate of each farm was 0-16.33%， with an average incidence rate of 9.69%， which was lower than the infection rate of ORFV.

Key words： Sore mouth disease; Epidemiology; PCR diagnosis; Pingnan County

屏南縣位于福建東北部鷲峰山脈中段，全縣草場總面積2.88萬hm2，占山地面積的24.2%。天然草場年日照平均總時數為1720 h，年活動積溫為4565.6℃，冬暖夏涼，十分有利于牧草生長，為肉羊產業的發展提供了得天獨厚的資源。近年來，屏南縣肉羊產業的規模養殖已初見成效，百頭以上的規模養羊場約占屏南縣年末存欄總數的80%[1]。

羊口瘡病是由羊口瘡病毒（orf virus，ORFV）感染引起羊急性、接觸性人畜共患病，患病羔羊的采食和吸吮乳汁受到嚴重影響，還易并發其他疫病，是造成養羊產業經濟損失的主要疫病之一[2]。目前缺乏用于臨床治療羊口瘡病的特效藥，采用取弱毒活疫苗進行防治也存在毒力返強的風險，造成了該病防治的困難[3]。因此，開展羊口瘡病的流行病學調查，掌握病毒在羊群中的分布，是預防疾病的關鍵舉措[4-5]。為了解屏南縣養殖羊群的羊口瘡病分布與發病情況，在全縣范圍內采用PCR方法開展羊口瘡病原的診斷，為該病的科學防治提供參考依據。

1?材料與方法

1.1病樣采集及流行病學調查

以2018年3月至6月間縣域內12份臨床診斷為羊口瘡病的病羊為研究對象，每個病例分別采集口、唇部結痂病變組織約100 mg和抗凝頸靜脈血0.5 mL。采集的組織加入約2 mL生理鹽水，研磨后收集勻漿1 mL，-20℃保存備用;病例頸靜脈血放置于2 mL滅菌離心管中，-20℃保存備用。

1.2病毒基因組DNA提取病毒DNA提取試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司，病變組織樣本取200 uL勻漿液，血液取200 uL，均按照試劑盒的操作說明分別進行各樣品病毒基因組DNA的提取，提取的病毒基因組DNA于-20℃保存備用。

1.3羊口瘡病毒（ORFV）PCR擴增的引物設計與反應體系

用于羊口瘡診斷的PCR引物參考顏新敏等[5]設計，目的擴增片段長度為507 bp。上游引物為：5′-CGAACTTCCACCTCAACCACTCC-3′，下游引物為：5′-CCTTGACGATGTCGCCCTTCT-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR擴增體系為：提取的病毒基因組DNA 模板2 uL，2×Premix Taq酶（北京全式金生物科技有限公司）10 uL，上下游引物（25 pmol·uL-1）各1 μL，無菌ddH2O 6 uL。PCR反應條件：94℃變性2 min，40個循環擴增（94℃50 s、56℃40 s、72℃30 s），72℃延伸5 min，4℃1 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

1.4?羊口瘡病毒（ORFV）的PCR檢測

分別以12份羊口瘡病例的病變組織、血樣提取的病毒基因組DNA為模板進行PCR擴增，并以等量無菌ddH2O替代模板設置空白對照，擴增后進行凝膠電泳。

1.5?屏南縣羊口瘡病毒（ORFV）流行病學調查

于2018年7月至10月，在屏南縣縣域內6個鄉鎮百頭以上規模戶進行羊口瘡病的流行病學調查，每個羊場按存欄量的30%進行隨機抽樣。抽中的羊只利用加抗凝的一次性采血針采集0.5 mL頸靜脈血，-20℃存放備用。檢測方法參照以上方法。

2?結果與分析

2.1?羊口瘡病毒（ORFV）的PCR檢測結果

由圖1可知，12份病例的病變組織、血樣提取的病毒基因組DNA樣品均擴增出約500 bp片段，與預期片段大小一致，空白對照則無條帶。表明引起屏南縣臨床羊口瘡病的病原為羊口瘡病毒（ORFV），該PCR診斷方法可用于臨床羊口瘡病的病原診斷，利用PCR技術可以檢測羊只血液羊口瘡病毒（ORFV）的感染情況。

2.2?屏南縣羊口瘡病毒（ORFV）的流行病學調查結果

屏南縣6家存欄量百頭以上養羊規模場（戶）的羊口瘡病流行病學調查結果見表1。由表1可知，各養殖戶羊群均存在羊口瘡病毒的感染，感染率為14.63%～33.33%，平均感染率為25.99%，說明羊口瘡病在屏南縣廣泛存在且感染率較高。抽樣調查的群體中有羊口瘡臨床病癥的羊只均為1～3月齡羔羊，各養殖場臨床發病率為0～16.33%，平均發病率為9.69%，低于羊群羊口瘡病毒（ORFV）的感染率，這主要是由于3月齡以上的感染羊只并非臨床發病羊只。經過對抽樣羊只個體的對比，臨床發病羊只血液羊口瘡病毒（ORFV）的PCR檢測均為陽性，進一步證實了PCR技術對羊口瘡病毒（ORFV）診斷的準確性。

3?討論

我國多地均有羊口瘡病的報道，給養羊產業造成了巨大的經濟損失[6]。在臨床上，羊只感染羊口瘡病后的癥狀與羊痘、口蹄疫等疫病的癥狀非常相似，特別是存在繼發或混合感染時，更增加了臨床診斷的難度

[7]。因此，能準確對臨床感染病羊進行病原確診以及定期調查羊口瘡病原在羊群中的分布是科學防治該疫病的關鍵[8]。利用電鏡、病毒分離等常規病毒診斷方法確診羊口瘡病毒費時費力，且需要昂貴的設備，不適合在臨床診斷中應用，而血清學診斷往往存在交叉反應[9]。目前常利用羊口瘡病毒（ORFV）的特異保守序列設計引物，進行PCR擴增后進行羊口瘡病毒的臨床確診[4-5]。常亮等[7]研究表明利用PCR方法檢出羊口瘡病毒（ORFV）的最低量為5 pg。林裕勝等[10]建立的羊口瘡病毒（ORFV）和絲狀支原體雙重PCR方法對羊口瘡病毒（ORFV）的最低檢測出量為3.8×104 Copies·uL-1，具有良好的特異性和敏感性。本研究表明羊口瘡發病羊只的病變組織和血樣的PCR檢測結果均為100%陽性，進一步證實了利用PCR技術在臨床上檢測羊口瘡病毒，具有快速、簡單和準確性高的優點，且其對試驗條件要求較低，適用于一般實驗室診斷。

羊口瘡病在屏南縣養殖羊群中的流行由來已久，2007年蘇雅英[11]在屏南縣屏城鄉散養戶中臨床診斷了羊口瘡病的疑似病例，但缺乏對病原的確診認定。董曉寧等[4]首次在福建省開展了羊口瘡病的流行病學調查，表明該病在福建省的發病率為10%～20%，與本研究調查的屏南縣羊口瘡病發病率為0～16.33%的結果較為一致。屏南縣羊口瘡病的流行病調查結果表明羊群羊口瘡病毒（ORFV）的感染率高于發病率，常亮等[7]對甘肅東部地區羊口瘡病毒PCR檢測調查表明該地區羊群羊口瘡感染率遠高于發病率，與本研究結果一致。分析認為造成這一現象的原因：一方面是由于部分羊只發病的臨床癥狀輕，造成臨床診斷的漏診，另一方面放牧羊口瘡病多發于6月齡以內的羔羊，但病毒會在6月齡以上的羊群中長期攜帶[7]。

目前臨床治療羊口瘡的特效藥尚缺乏，且通過藥物治療傳染性疫病也并不經濟，通過疫苗接種仍然是免疫防治羊口瘡病的主要方法[12]。但由于羊口瘡病毒免疫的特殊性和其他一些原因，至今為止尚未研制成功安全、高效的羊口瘡病毒疫苗，臨床上常用的弱毒疫苗存在毒力返強等缺點[13]。因此，在生產中科學防控羊口瘡病的先決條件是掌握羊口瘡病毒（ORFV）在羊群中的流行情況，在此基礎上加強對易感羔羊的照料，對發病羊只及時治療，隔離帶毒羊群和易感羊群，逐步淘汰老、弱帶毒羊只，定期消毒以減少病毒在羊群中的感染機會。

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（責任編輯：林玲娜）