年糕殺菌工藝及其對年糕中微生物影響的研究

孫同輝，陳 潔*，許 飛，陳 玲

1.河南工業大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001 2.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640

年糕是一種歷史悠久的半方便性米制品，具有濃郁的地方特色[1]。年糕水分含量較高，且制作與貯藏過程中原輔料、半成品及成品都直接與水或空氣接觸[2]，很容易受到細菌、真菌污染發生變質而失去食用價值，甚至引發食物中毒[3]，所以年糕普遍存在貨架期短等問題，從而影響這一傳統食品的工業化持續發展[4]。

傳統的年糕保鮮技術主要有高溫高壓滅菌和巴氏殺菌技術。經高溫高壓滅菌的年糕雖然有較長的保質期，但容易發硬和變黃，難以保持原有口感；經巴氏殺菌的年糕，由于殺菌不徹底容易導致發霉變質[5]。李共國等[6]研究了殺菌條件對年糕色澤、硬度和咀嚼度等的影響，殺菌溫度過高會產生褐變和硬度增大等現象；蔡懷依等[7]等研究了乙醇噴涂對年糕保鮮效果的影響，結果表明，乙醇噴涂可以控制年糕硬度增大和褐變，有效防止水分流失，雖然有較好的抑菌殺菌效果，但可能會影響年糕原有的米香味。

作者通過正交試驗對酸洗結合水浴處理的殺菌方式進行優化，得到最優殺菌工藝。同時采用傳統分離鑒定方法對年糕中微生物菌群進行分析，探究殺菌工藝對微生物菌群的影響，為年糕保鮮技術的進一步開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

糯米：中糧米業(五常)有限公司；粳米：中糧米業(巢湖)有限公司；高溫蒸煮袋：滄州華良包裝裝潢有限公司。

1.1.2 試劑

平板計數瓊脂、孟加拉紅培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)：北京奧博星生物技術有限責任公司；營養瓊脂培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司；乳酸、瓊脂粉：天津市科密歐化學試劑有限公司；氯化鈉、無水乙醇：天津市天力化學試劑有限公司；DNA提取試劑酚：北京索萊寶科技有限公司；2×Power Tap PCR Master Mix：天根生化科技(北京)有限公司；引物P0、P6、ITS1、ITS4：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設備

MFD15多功能一步成型機：廣東衡聯食品機械有限公司；400型真空(充氣)包裝機：鄭州星火包裝機械有限公司；雙哈牌YX280型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器：上海三中醫療器械有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；TC-300 PCR儀：英國Techne公司；QL-866型旋渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；5418 R 離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 年糕加工工藝流程

原料米(粳米、糯米)→淘洗→浸泡7 h→擠壓熟化→膠凝化→酸洗→瀝干→真空包裝→水浴滅菌。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 酸洗液體積分數對年糕品質的影響

將凝膠化后的年糕用0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%的乳酸洗液沖洗5 min，瀝干表面水分，用高溫蒸煮袋真空包裝，95 ℃水浴30 min，37 ℃放置10 d，測定初始菌落總數并進行感官評價，每組試驗平行進行3次。

1.3.2.2 酸洗時間對年糕品質的影響

將凝膠化后的年糕用1.0%的酸洗液分別沖洗1、5、10、20、30 min，瀝干表面水分，用高溫蒸煮袋真空包裝，95 ℃水浴30 min，37 ℃放置10 d，測定初始菌落總數并進行感官評價，每組試驗平行進行3次。

1.3.2.3 水浴溫度對年糕品質的影響

將凝膠化后的年糕用1.0%的酸洗液沖洗5 min，瀝干表面水分，用高溫蒸煮袋真空包裝，85、90、95、100 ℃水浴處理30 min，37 ℃放置10 d，測定初始菌落總數并進行感官評價，每組試驗平行進行3次。

1.3.2.4 水浴時間對年糕品質的影響

將凝膠化后的年糕用1.0%的酸洗液沖洗5 min，瀝干表面水分，用高溫蒸煮袋真空包裝，95 ℃水浴處理20、30、40、50 min，37 ℃放置10 d，測定初始菌落總數并進行感官評價，每組試驗平行進行3次。

1.3.3 正交試驗

在單因素試驗基礎上，以初始菌落總數和感官評分為評價指標，選取酸洗液體積分數、酸洗時間、水浴溫度和水浴時間為考察因素，設計四因素三水平正交試驗，因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.3.4 微生物總數測定

參照GB 4789.2—2016和GB 4789.15—2016測定微生物總數。

1.3.5 感官評價方法

由專業感官評定小組對年糕的色澤、彈性、口感、硬度和風味等指標進行綜合評價，年糕感官評價標準見表2。

1.3.6 殺菌工藝對年糕微生物菌群的影響

1.3.6.1 年糕中微生物菌群提取

分別取3袋鮮樣期和殺菌后的年糕樣品，在無菌條件下各取25 g加入225 mL生理鹽水中，剪碎后用均質器均質2 min，取不同稀釋梯度的菌懸液，分別在平板計數瓊脂和孟加拉紅培養基培養計數，觀察、編號并記錄菌落形態，計算各菌種所占比例[8-9]。選取符合計數條件的平板，挑取不同菌落形態且占比較大的菌落進行反復劃線分離至菌落較純。在進行劃線提純時，細菌在營養瓊脂培養基上36 ℃培養48 h；真菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上28 ℃培養5 d。

表2 年糕感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria for rice cake

1.3.6.2 年糕中微生物菌群DNA提取

細菌和真菌DNA模板提取參考文獻[10]的傳統分離培養方法。

1.3.6.3 基因擴增

以提取的DNA稀釋液為PCR擴增反應的模板，以無菌雙蒸水為模板作陰性對照，利用25 μL反應體系(正向引物、反向引物各1 μL，酶(2×Power Tap PCR Master Mix)12.5 μL，雙蒸水9.5 μL，模板DNA 1 μL)進行PCR擴增。真菌擴增程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環，72 ℃保持10 min，所用引物為ITS1和ITS4；細菌擴增程序：PCR循環中變性時間為1 min，退火時間為1 min，延伸時間為1.5 min，所用引物為P0和P6[9](P0∶5′-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3′；P6∶5′-CTA CGG CTA CCT TGT TAC-3′)。

1.3.6.4 基因測序及序列分析

將PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將結果與NCBI GenBank數據庫的Blast程序中已知的序列進行比對，獲取同源性較高的菌株的序列信息，并鑒定微生物種類。

1.4 數據處理

采用IBM SPSS Statistics 24 和 Origin 2017 進行數據處理與統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酸洗液體積分數對年糕品質的影響

如圖1所示，隨酸洗液體積分數的增加，年糕初始菌落總數呈逐漸遞減的趨勢，主要是因為隨著酸洗液體積分數的增加，酸洗液中H+濃度增加，酸洗相同時間時，年糕表面H+濃度逐漸升高，pH值越低，抑菌效果越好[11]。隨酸洗液體積分數的增加，年糕感官評分呈先上升后下降的趨勢，乳酸為食品酸味劑，在一定程度上可以改善食品風味[12]，但酸洗液體積分數過大會導致年糕有明顯乳酸味道[13]，嚴重影響其風味和口感。酸洗液體積分數為1.0%和2.0%時，感官評分較高，但酸洗液體積分數為1.0%時的抑菌效果較差，因此選定酸洗液體積分數為2.0%。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，圖2、圖3、圖4同。圖1 酸洗液體積分數對年糕初始菌落總數與感官評分的影響Fig.1 Effect of the volume fraction of pickling solution on the total number of initial colonies and sensory score of rice cake

2.1.2 酸洗時間對年糕品質的影響

圖2 酸洗時間對年糕初始菌落總數與感官評分的影響Fig.2 Effect of pickling time on the total number of initial colonies and sensory score of rice cake

如圖2所示，隨著酸洗時間延長，年糕初始菌落總數呈逐漸降低的趨勢，酸洗時間越長，可以使乳酸充分作用于年糕，增加年糕表面H+濃度，從而達到較好的抑菌效果。隨著酸洗時間延長，年糕感官評分呈先上升后下降的趨勢，大米淀粉在酸性條件下水解糊化形成的凝膠網絡結構可吸附水分子，具有一定的保水效果[14]，在合適的時間內，會使年糕的口感風味變好，但如果酸洗時間過長，會破壞年糕表面的凝膠膜狀態，令其粘連、爛糊[11]，導致年糕感官評分降低。綜合考慮，選定酸洗時間為20 min。

2.1.3 水浴溫度對年糕品質的影響

熱殺菌是食品加工與保存中用于改善食品品質、延長貯藏期最重要的處理方法之一[15]。如圖3所示，隨著水浴溫度升高，年糕體系中初始菌落總數呈逐漸下降趨勢，水浴時間相同時，水浴溫度越高，殺菌抑菌效果越好。隨著水浴溫度升高，年糕感官評分呈先升高后逐漸下降趨勢，水浴溫度越高，年糕褐變越嚴重[4]，硬度會隨著水浴溫度升高而增加，導致年糕口感變差，食用品質降低。沈慶霞等[16]發現年糕直鏈淀粉含量隨著滅菌溫度的增加而有所升高，在淀粉高溫糊化后的冷卻凝膠過程中，淀粉分子通過氫鍵交聯聚合，直鏈淀粉含量越高，生成的氫鍵越多，使凝膠硬度增大，進而表現為年糕硬度增加，嚴重影響食用品質，導致年糕感官評分降低。

圖3 水浴溫度對年糕初始菌落總數與感官評分的影響Fig.3 Effect of water-bath temperature on the total number of initial colonies and sensory scoreof rice cake

2.1.4 水浴時間對年糕品質的影響

如圖4所示，隨著水浴時間的延長，初始菌落總數呈下降趨勢，相同水浴溫度時，水浴時間越長，年糕內部熱傳遞效果越好，從而抑制微生物的生長繁殖，達到較好的抑菌殺菌效果。隨著水浴時間的延長，年糕感官評分先升高后逐漸降低。水浴時間越長，年糕色澤變黃、質地變硬現象越明顯，同時會使年糕發生粘連和嚴重變形，還顯著影響其復水性能[17]，導致年糕在貯藏期內食用品質下降。

圖4 水浴時間對年糕初始菌落總數與感官評分的影響Fig.4 Effect of water-bath time on the total number of initial colonies and sensory score of rice cake

2.2 正交試驗

正交試驗結果見表3，方差分析見表4。

由表3可知，各因素對初始菌落總數影響的主次順序為D>C>B>A，最優組合為A3B3C2D2，即酸洗液體積分數3.0%、酸洗時間15 min、水浴溫度95 ℃、水浴時間40 min；各因素對感官評分影響的主次順序為A>C>B>D，最優組合為A1B3C2D1，即為酸洗液體積分數2.0%、酸洗時間15 min、水浴溫度95 ℃、水浴時間30 min。由表4可知，酸洗液體積分數、水浴溫度和水浴時間對初始菌落總數均有極顯著影響，酸洗時間有顯著影響；酸洗液體積分數對感官評分有極顯著影響，水浴時間對感官評分影響不顯著。綜合考慮，選定最優方案為A1B3C2D2，即酸洗液體積分數2.0%、酸洗時間15 min、水浴溫度95 ℃、水浴時間40 min。采用優化后的殺菌工藝進行3次驗證試驗，年糕常溫貨架期可達6個月，且品質保持較好。

表3 正交試驗設計及結果Table 3 Results of orthogonal design

2.3 殺菌工藝對年糕中微生物菌群的影響

將鮮樣期和殺菌后的年糕分組編號為①和②，將測序結果與NCBI數據庫進行同源性比對，年糕中細菌和真菌序列分析見表5、表6。通過累積柱狀圖對年糕中的微生物菌群相對豐度做進一步說明，結果見圖5、圖6。

由表5和圖5可知，在屬水平上，鮮樣期年糕中芽孢桿菌屬(Bacillus)所占比例最大，約為88.24%，其次為微球菌屬(Micrococcus)，所占比例為6.75%，產酸克雷伯桿菌(Klebsiellaoxytoca)占5.00%，其他菌屬占0.01%；殺菌后年糕中細菌腐敗菌種類迅速減少，以芽孢桿菌屬(Bacillus)為主，其他腐敗菌已被殺死或濃度低于檢出限，未被檢測到。綜上所述，此殺菌工藝可以有效抑制年糕中細菌的生長繁殖，達到較好的殺菌抑菌效果。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

注：*表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01。

由表6和圖6可知，在屬水平上，鮮樣期年糕中的真菌菌屬分別是青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、籃狀菌屬(Talaromyces)，所占比例分別為63.63%、22.32%和14.03%。殺菌后年糕中青霉屬所占比例較大，約為82.34%，籃狀菌屬占17.66%，青霉屬廣泛分布于土壤、空氣、植物和室內等環境中，能夠分泌具有高活性的蛋白質、多糖和脂肪等大分子物質的水解酶類[18-20]。此外青霉屬的適應能力很強，對營養物質、pH值和溫度變化的敏感性較弱，在食品加工過程中，其有性型籃狀菌亞屬的有性孢子比無性孢子的耐熱性和抗性均較強，不易被殺死[21]。

表5 年糕中細菌序列分析Table 5 Bacterial sequence analysis of rice cake

表6 年糕中真菌序列分析Table 6 Sequence analysis of fungi in rice cake

圖5 年糕中細菌菌種的相對豐度Fig.5 Relative abundances of bacterial strains in rice cake

圖6 年糕中真菌菌種的相對豐度Fig.6 Relative abundances of fungal strains in rice cake

3 結論

采用酸洗結合水浴處理的殺菌方式，以初始菌落總數和感官評分為評價指標，設計正交試驗對殺菌工藝進行優化。結果表明，最優殺菌工藝為酸洗液體積分數2.0%、酸洗時間15 min、水浴溫度95 ℃、水浴時間40 min。通過傳統分離鑒定方法對年糕中的微生物菌群進行分析，發現鮮樣期年糕中細菌主要有芽孢桿菌屬、微球菌屬、產酸克雷伯桿菌及少量其他雜菌，真菌主要有青霉屬、曲霉屬和籃狀菌屬。殺菌后年糕中細菌主要是芽孢桿菌屬，真菌主要是青霉屬，殺菌后年糕貨架期可達6個月，殺菌工藝可以有效抑制年糕中微生物的生長繁殖，同時為進一步開發年糕保鮮措施提供依據。