胎盤淋巴細胞凋亡及CD44表達水平與子癇前期的相關性研究*

黃 海，陳 梅，馬 麗，李景平

深圳市南山區西麗人民醫院，廣東 深圳 518000

子癇前期(Preeclampsia，PE)是妊娠期特發的多系統類型疾病，是一種因血管痙攣致器官灌注量低于內皮激活的繼發疾病。該疾病對圍生期母嬰安全造成極大威脅而作為產科病理學的重點研究項目，現有研究未能較好闡明該病的發病機制，對子癇前期的早診治產生不良影響。CD44為最主要的淋巴細胞歸巢受體，其在淋巴細胞再循環、活化及炎癥反應中發揮重要作用，影響母體與胎兒的免疫平衡。現有研究認為胎盤滋養細胞的凋亡及Fas/FasL調控系統的表達與子癇前期發生存在聯系，較少研究提出CD44在子癇前期產婦淋巴細胞中的表達與淋巴細胞凋亡相關性，本研究本研究通過對我院子癇前期產婦及正常產婦胎盤淋巴細胞凋亡及CD44表達水平來探索其與子癇前期的相關性，現將本次研究報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以深圳市南山區西麗人民醫院2016年6月1日-2017年11月30日住院分娩的無產科合并癥及內外科合并癥產婦120例為研究對象，其中子癇前期產婦60例為研究組，正常產婦60例為對照組。子癇診斷標準：以《實用婦產科學》［1］中有關子癇前期的診斷標準為標準進行臨床診斷，同時排除除子癇前期外其他產科合并癥與內外科合并癥。選擇標準：所有產婦均無其他產科合并癥且為單胎妊娠，研究組產婦須符合子癇前期診斷標準。所有產婦均對研究干預知情同意并簽署知情同意書。排除存在其他妊娠合并癥、可影響胎盤淋巴細胞凋亡及CD44表達水平合并癥產婦。所納入的產婦中，研究組年齡范圍（23～34）歲，平均年齡（28.76±3.59）歲，孕周數（37～40）歲，平均孕周數（37.97±0.93）周，對照組年齡范圍（23～33）歲，平均年齡（28.31±3.62）歲，孕周數（37～40）歲，平均孕周數（37.84±0.73）周。兩組一般資料無明顯差異，P＞0.05，具有對比價值。本研究內容經我院倫理委員會批準同意。

1.2 方法

1.2.1 實驗器材：淋巴細胞分離液（級別：BR，密度：1.077±0.002 g/ml，PH（25℃）：6.5～7.5）；一步法RNA抽提試劑盒（規格：500 ml/100 ml）；RT-PCR試劑盒（規格：P4251-100G）；全蛋白提取試劑盒（型號：BC3640-50T）。

1.2.2 操作方法：于產婦入院完成各項檢查確定符合研究標準后進行外周EDTA抗凝血及胎盤母體面中央絨毛組織樣本采集，采集完成后使用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞備用。

CD44 mRNA表達水平檢測方法：以RNA抽提試劑盒抽提總RNA并在Gene bank中查得CD44的基因系列，借助Primer 3.0軟件進行引物與探針設計，采用RT-PCR通用試劑盒檢測CD44的mRNA水平。

CD44蛋白水平檢測方法：使用蛋白提取試劑盒提取淋巴細胞總蛋白，進行電泳凝膠的制備。電泳完成后切割膠條，轉膜緩沖液平衡5 min，共3次。提前剪裁膠條同面積的濾紙與NC膜，放入轉膜液中持續10 min。按照順序安裝轉膜裝置，量NC膜、凝膠與濾紙精準對齊，清除旗袍并加壓500 g物品，碳板中多余液體予以吸干。接通電源后以1 mA/cm2的橫流轉移1.5 h，完成后取模取待測膜條進行免疫印跡法。將有蛋白標準的條帶進行染色，50 s后在進行脫色，雙蒸水清晰，風干并在兩層濾紙間保存。免疫反應：洗膜（0.01M PBS，5 min/次，共3次），加包被液于室溫環境下平穩搖晃2 h。扔去包被液再洗洗膜，5 min/次，共3次。加入CD44單抗，使用0.01M PBS稀釋至合適比例并覆蓋膜，4℃溫度條件下放置＞12 g。陰性對照將一抗替換為1%BSA，余下步驟同實驗組。0.01M PBS分別洗膜，5 min/次，共4次。加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗（同上稀釋法），室溫下平穩搖動2 h。棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5 min/次，共4次。加入顯色液，避光狀態下顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終止反應。

淋巴細胞凋亡檢測方法：染色：取約2.0×106淋巴細胞，加入適量的Annexin V-FITC和PI試劑，室溫避光孵育30 min，加入預冷的PBS液離心洗滌2次，以除去未結合的多余抗體成分，采用1%的多聚甲醛溶液重懸細胞。流式細胞術：將上述染色后的細胞標本上流式細胞儀檢測淋巴細胞凋亡率（凋亡細胞：PI陰性Annexin V陽性的細胞）。

1.3 統計學方法

所有數據經SPSS19.0處理，計量資料以均數±標準差（)表示，組間比較采用t檢驗；以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組產婦的胎盤淋巴細胞凋亡率與CD44表達水平對比

結果顯示，研究組產婦的CD44表達水平與淋巴細胞凋亡率均高于對照組，兩組差異有統計學意義（t=4.454，2.100）；P＜0.05，提示CD44表達水平與胎盤淋巴細胞凋亡率呈現正相關性，CD44水平與子癇前期的發生存在一定相關性，見表1。

表1 兩組產婦的胎盤淋巴細胞凋亡率與CD44表達水平對比（） %

表1 兩組產婦的胎盤淋巴細胞凋亡率與CD44表達水平對比（） %

組別研究組（n=30）對照組（n=30）t P胎盤淋巴細胞凋亡率15.72±2.24 13.24±2.07 4.454 0.000 CD44表達水平38.03±6.21 25.14±4.23 2.100 0.020

3 討論

現有研究認為胎盤淺著床，血管重鑄障礙、免疫異常、凋亡過度、滋養細胞浸潤能力異常等與子癇的發生具有較強關聯性［2］。正常妊娠的維持，有賴于胎兒母體間免疫平衡的建立與穩定，而這種平衡一旦失調，即可導致子癇前期的發生［3］。母胎界面的蛻膜內有絨毛外滋養層細胞、免疫細胞和蛻膜細胞組成的相互影響、相互制約的網絡狀免疫微環境。其淋巴細胞中，大顆粒淋巴細胞（NK）的比例高達45%，且處于特定的功能狀態。CD44是最主要的淋巴細胞歸巢受體，參與淋巴細胞的再循環，淋巴細胞活化及炎癥反應，并在母胎免疫耐受中起重要作用。目前普遍認為，胎盤淺著床和血管重鑄障礙是子癇前期發病的中心環節，而這兩者都與細胞滋養細胞浸潤能力降低有關［4］。淋巴細胞凋亡異常可導致母胎界面滋養細胞凋亡異常，致使細胞滋養細胞向子宮內膜侵入不良—“淺著床”和血管重鑄障礙，繼而導致子癇前期的發生。在張亞明［5］的研究中提出調節性T淋巴細胞水平較低，對Th1細胞增殖抑制力減小，從而促使Th1/Th2的平衡偏向Th1,使其不能對胚胎抗原產生免疫抑制保護作用，外周血中NK細胞升高影響滋養細胞的正常功能，產生血管重鑄障礙從而促發子癇前期。這與本研究中子癇前期產婦的胎盤淋巴細胞凋亡率高存在一致性，免疫反應增強而淋巴細胞數量增多，凋亡增多，研究組產婦的CD44表達水平與淋巴細胞凋亡率均高于對照組，提示CD44表達水平與胎盤淋巴細胞凋亡率呈現正相關性，CD44水平與子癇前期的發生存在一定相關性。

綜上所述，胎盤淋巴細胞凋亡率與CD44表達水平呈現正相關性，正常產婦的胎盤淋巴細胞凋亡率低且CD44表達水平低，CD44表達高水平在預測子癇前期中具有一定參考價值。