經耳緣靜脈注射ADSCs修復兔SANFH的效果及細胞定植研究*

齊新文

遵義醫科大學第五附屬（珠海）醫院骨二科，廣東 珠海 519100

激素性股骨頭壞死（Steroid-induced avascular necrosis of the femoral head,SANFH）是因長期大劑量應用激素所引致的一種代謝性疾病［1］，其致殘性高，對社會產生較大影響［2］。因此，尋求針對SANFH有效的治療方法，具有重要的臨床意義［3］。本研究通過經耳緣靜脈注射的方式移植經Brdu標記的脂肪干細胞（Adipose mesenchymal stem cells，ADSCs），觀察ADSCs在壞死股骨頭區的定植情況及其對SANFH的修復效果，試圖尋求一種有效干預SANFH的新方法，研究結果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

45只體重為2.5～3.0 kg的雄性新西蘭大白兔，均為8月齡，于廣東省實驗動物中心購買，許可證號為SCXK(粵)20140035。各兔單獨分籠飼養，自由飲水及進食飼料。實驗中所有操作與動物倫理學要求相符。

1.2 實驗試劑及儀器

溴脫氧尿嘧啶核苷（Bromodeoxyurdine，BrdU）（廣州璽美生物科技有限公司）；馬血清（SH30074.03，Hyclone）；DMEM培養基（SH30243.01，Hyclone）； 125mg注射用甲基強的松龍（武漢新星生物藥業有限公司）；離心機（Thermo-ST16,上海仁器儀器公司）;石蠟切片機（RM2235,德國Leica公司）；電子顯微鏡（日本尼康公司）。

1.3 方法

1.3.1 建立兔激素性股骨頭壞死模型：從實驗兔中隨機選取3只兔作分離ADSCs用，均不用于造模，余42兔作為建模兔。將各建模兔經耳緣靜脈注射10 ml/kg馬血清，3周后各兔經耳緣靜脈注射5 ml/kg馬血清。最后一次注射馬血清后兩周，經腹腔注射5 ml/kg甲基強的松龍，連續注射3 d，兩周后各建模兔麻醉后完善髖部正位片及髖部磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）檢查了解股骨頭情況。以髖關節正位片見股骨頭密度欠均勻、囊性變，同時髖部MRI見股骨頭軟骨下帶狀低信號，關節積液增多，認為兔激素性股骨頭壞死模型建立成功［4］。

1.3.2 建模后分組：隨機選取36只造模成功的兔進行隨機分組，分為靜脈注射組、局部注射組及對照組，每組各12只兔。

1.3.3 兔ADSCs的提取及培養傳代：將非造模兔經耳緣靜脈注射10%水合氯醛（劑量為1.5 ml/kg）充分麻醉后，將兔固定于固定板上，消毒后從頸項部切取約3 g脂肪組織。磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖冼3次后剪至糊狀放入無菌瓶中，加入0.1%Ⅰ型膠原酶溶解，吸出溶液5 ml，并同量完全培養基一起加入到15 ml離心管中離心5 min，過濾后接種于培養瓶中，置入培養箱中（37℃，5%CO2）培養，將細胞傳代至第3代。將第3代細胞進行流式細胞學鑒定確認為ADSCs。

1.3.4 溴脫氧尿嘧啶核苷（Bromodeoxyurdine，BrdU）標記ADSCs并制成細胞溶液：取第3代ADSCs接種于T25培養瓶中進行培養，細胞濃度為1×105/cm2。待細胞匯合度達80%，往培養瓶中加入100μl濃度為10μmol/L的BrdU，于培養箱內孵育48 h。將ADSCs經消化離心后，加入單純高糖培養基重懸細胞，制成1×107/ml的細胞懸液備用。

1.3.4 兔ADSCs移植干預兔激素性股骨頭壞死：局部注射組：將各兔左髖部備皮、消毒并鋪無巾后，依次置于X線機下，俯臥位，充分固定四足后，使用5 ml注射器從左髖關節刺入，X線機攝片證實注射器尖端已達股骨頭后，注入 5ml經BrdU標記的ADSCs。靜脈注射組：將兔右耳緣靜脈局部充分備皮后，經耳緣靜脈注入5 ml已標記BrdU的ADSCs。對照組不作任何干預。

1.3.5 干預后4周、8周各組兔股骨頭組織學分析：于干預后第4周、第8周各組隨機選取6只模型兔，處死后切取各組兔左側股骨頭將各兔左側股骨頭進行脫鈣、脫水、透蠟并包埋，切片脫蠟至水。將各兔股骨頭切片分成兩部份，一部份作HE染色，100倍顯微鏡下觀察各組兔兩時間點股骨頭骨陷窩、骨小梁情況，并計算空骨陷窩率；一部份作Brdu免疫組化染色，100倍顯微鏡下觀察BrdU標記的ADSCs經靜脈移植后在病變股骨頭的定植情況，并計數Brdu陽性細胞數量。

1.3.6 統計學方法

數據采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（）表示，干預后同一時間點各組間比較，采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兔激素性股骨頭壞死模型的建立情況

42只大白兔經靜脈注射馬血清聯合腹腔注射甲基強的松龍后，2兔出現死亡，考慮腹腔注射后出現感染所致，共37兔建模成功。

2.2 各組兔干預后4周、8周股骨頭組織形態變化

干預后4周：對照組可見較多空骨陷窩及脂肪細胞、骨小梁稀疏，而局部注射組、靜脈注射組空骨陷窩及脂肪細胞數量較對照組少，骨小梁稍稀疏。

干預后8周：對照組可見空骨陷窩及脂肪細胞數量較干預后4周增多，部分脂肪細胞已融合成團，可見骨小梁斷裂；局部注射組及靜脈注射組可見空骨陷窩及脂肪細胞數量極少，骨小梁較致密。

2.3 各組兔干預后4周、8周股骨頭空骨陷窩率測定

于干預后4周、8周分別測量各組兔股骨頭空骨陷窩率，結果可見干預后4周、8周局部注射組及靜脈注射組的空骨陷窩率均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），而局部注射組與靜脈注射組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。干預后8周局部注射組及靜脈注射組空骨陷窩率均低于同組干預后4周，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 干預后4周、8周各組股骨頭空骨陷窩率（） %

表1 干預后4周、8周各組股骨頭空骨陷窩率（） %

注：*表示在干預后4周與對照組比較，P＜0.05；#表示在干預后8周與對照組比較，P＜0.05。

P t組別對照組（n=6）局部注射組（n=6）靜脈注射組（n=6）10.94 14.49 18.26 0.00 0.00 0.00 FP干預后第4周44.77±1.27 37.45±0.84*36.87±0.45*137.76 0.00干預后第8周50.35±0.57 32.40±0.46#31.93±0.47#2633.50 0.00

2.4 各組兔干預后4周、8周后Brdu免疫組化染色

于干預后4周、8周，局部注射組及靜脈注射組可見細胞核呈棕褐色的Brdu標記陽性細胞，并隨時間推移，陽性細胞增多。對照組于干預后第4周、第8周均未見經Brdu標記的陽性細胞。干預后8周局部注射組及靜脈注射組Brdu陽性細胞數均高于同組干預后4周（P＜0.05）；而于干預后4周、8周局部注射組與靜脈注射組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 干預后4周、8周各組Brdu陽性細胞數（） %

表2 干預后4周、8周各組Brdu陽性細胞數（） %

注：*表示與同組干預后4周作比較，P＜0.05。

組別局部注射組（n=6）靜脈注射組（n=6）t P 0.00 0.00干預后8周35.19±1.01*34.78±1.56*0.60 0.56干預后4周23.23±1.03 22.87±1.75 0.49 0.64 22.74 13.913 tP

3 討論

SANFH是骨科臨床常見的難治性疾病［5］，目前其保髖治療方法如藥物及物理治療、高壓氧治療、髓芯減壓手術治療等均能起一定的療效，但遠期效果仍欠滿意［6］。目前已有研究指出局部注射移植干細胞可對激素性股骨頭壞死起較好的修復效果，其主要修復機制考慮與干細胞的多向分化能力促進骨修復及其分泌因子促進局部血管生成有關［7］，干細胞療法有望成為治療SANFH的良好療法［8］。本研究通過操作簡單的經耳緣靜脈注射方法，移植干細胞種類中易獲取、增殖能力強的ADSCs，觀察ADSCs在股骨頭的歸巢及其對股骨頭壞死的修復效果，探討靜脈注射ADSCs修復SANFH的可行性，目前該方面的研究國內外報道較少。

從Brdu免疫組化結果可得，干預后4周及干預后8周靜脈注射組均可見Brdu陽性細胞，并且隨著時間延長，陽性細胞會隨著增多，說明經耳緣靜脈注射的ADSCs可逐漸定植于壞死股骨頭區，并且從統計學分析結果可得，其定植數量與經局部注射移植無明顯差異，說明經靜脈注射ADSCs可在股骨頭達到與局部注射相近的細胞濃度。但經靜脈注射的ADSCs如何經血液循環到達有血運障礙的股骨頭區，具體機制需進一步研究。有研究指出，干細胞可特異性地歸巢于缺血或損傷的組織中［9］，這主要與組織缺血損傷后分泌的趨化因子及黏附分子有關［10］。經靜脈注射進入血液循環中的ADSCs，可能受到壞死股骨頭區分泌趨化因子及黏附分子的作用，從而定植于股骨頭區。

從組織學分析結果可見，于干預后4周、8周，局部注射組及靜脈注射組脂肪細胞數量均明顯比對照組少，而骨小梁均較對照組致密，空骨陷窩率兩干預組均低于對照組，但兩干預組的鏡下組織學表現與空骨陷窩率均無明顯差異。可見經耳緣靜脈注射ADSCs可對兔SANFH具有一定的修復效果，并且可能達到與局部移植相近的修復效果。

綜上所述，經耳緣靜脈移植ADSCs可定植于股骨頭區，對SANFH有一定的修復作用。