酒精性肝硬化患者血CTLA-4和PNPLA3基因多態(tài)性及其臨床意義分析*

張 冰,解學(xué)軍

酒精性肝硬化是酒精性肝病發(fā)展的結(jié)果,早期可能無明顯的癥狀。隨著疾病進(jìn)展,則可出現(xiàn)消瘦,食欲減退,乏力,牙齦出血等癥狀。如疾病進(jìn)一步惡化,還可出現(xiàn)面部晦暗、肝掌和肝性腦病等,嚴(yán)重危及患者生命健康。本病病因與患者長(zhǎng)期大量飲酒有關(guān)。此外,性別、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和遺傳因素也是本病的影響因素[1]。最新研究顯示,大量基因位點(diǎn)多態(tài)性與酒精性肝硬化的發(fā)生有關(guān),如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4,CTLA-4)和Patatin樣磷脂酶3(patatin-like phospholipase domain containing 3,PNPLA3)基因多態(tài)性等,其中CTLA-4是免疫球蛋白超基因的一種,主要存在于T細(xì)胞表面。CTLA-4即是白細(xì)胞分化抗原,也是T細(xì)胞跨膜受體,具有傳遞阻止信號(hào)和負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖等功能[2]。PNPLA3則是Patatin樣磷脂酶家族成員之一,具有磷脂酶和酰基轉(zhuǎn)移酶活性,同時(shí)也是脂質(zhì)代謝的重要參與因子[3]。既往研究顯示,PNPLA3 rs738409 GG型基因攜帶人群是酒精性肝硬化的高危人群,并且發(fā)現(xiàn)該基因不但與脂肪肝形成有關(guān),還與肝臟炎癥和肝纖維化等病理學(xué)改變密切相關(guān)[4]。本研究分析了110例酒精性肝硬化患者外周血CTLA-4和PNPLA3基因多態(tài)性的變化,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2017年1月～2019年1月在我院治療的酒精性肝硬化患者110例,男性98例,女性12例;平均年齡為(50.2±9.1)歲。平均每日飲用乙醇量為(65.3±11.3)g,診斷符合酒精性肝病防治指南的標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)本地常住漢族人群(居住時(shí)間超過1年)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有糖尿病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、甲狀腺疾病等其他疾病;(2)病毒性肝炎、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病等其他肝病;(3)合并有HIV感染。同時(shí),選擇無肝腎功能異常、糖尿病、高血壓病的不飲酒健康人100例作為對(duì)照,男性90例,女性10例;平均年齡為(49.9±9.1)歲。兩組受試者性別和年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)血CTLA-4基因rs4675369位點(diǎn)和PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)多態(tài)性(上海生工生物有限公司),即抽取兩組受檢人員靜脈血各5 ml,采用高鹽法提取外周血基因組DNA,使用美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)的Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度,行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。優(yōu)先擴(kuò)增目的基因片段,對(duì)應(yīng)上下游引物(上海生工提供)1.0 μl,10 mM 1.0 dNTP(北京百奧萊博科技有限公司)2 μl,Taq Buffer(美國(guó) Genscript公司)5.0 μl,Taq 酶(上海鈺博生物)0.5 μl,加去離子水至50 μl。PCR 反應(yīng)如下：95℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,57℃退火60 s,72℃延伸60 s,共35個(gè)循環(huán)。對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠(北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司)電泳,并于紫外燈下鑒定。使用美國(guó)ABI公司提供的3PROSM 3730測(cè)序儀對(duì)PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,確定樣本基因表型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0軟件處理和分析,對(duì)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),CTLA-4基因rs4675369位點(diǎn)基因型和等位基因比較采用卡方檢驗(yàn),采用 Hardy-Weinberg平衡法檢驗(yàn)樣本代表性,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CTLA-4和PNPLA3基因多態(tài)性情況 人CTLA-4基因rs4675369位點(diǎn)基因型有三種,分別為AA、AG和GG型;PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)基因型也有三種,分別為CC,GC和GG型。經(jīng)Hardy-Weinberg檢驗(yàn),酒精性肝硬化患者和健康人CTLA-4和PNPLA3基因分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.2 肝硬化與健康人CTLA-4基因rs4675369位點(diǎn)多態(tài)性分布比較 肝硬化和健康人CTLA-4基因rs4675369位點(diǎn)基因型和等位基因比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,表1)。

2.3 肝硬化與健康人PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)多態(tài)性分布比較 肝硬化患者PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)GG基因型和等位基因G比例顯著高于健康人(P＜0.05,表2)。

2.4 不同CTLA-4基因型肝硬化患者肝功能指標(biāo)比較 vCTLA-4基因rs4675369位點(diǎn)AA型、AG型和GG型酒精性肝硬化患者血清 ALT、AST、GGT和ALP水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,表3)。

2.5 不同PNPLA3基因型肝硬化患者肝功能指標(biāo)比較 PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)CC型、CG型和GG型酒精性肝硬化患者血清ALT、AST、GGT和ALP水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,表4)。

3 討論

酒精性肝硬化源于不良的生活習(xí)慣。因此,積極評(píng)估酒精性肝硬化危險(xiǎn)人群,并給予健康指導(dǎo)是本病的防治要點(diǎn)。近些年的研究顯示,基因多態(tài)性與酒精性肝硬化的發(fā)生密切相關(guān),一些研究[5,6]已證實(shí)酒精代謝酶、炎癥細(xì)胞因子、抗氧化酶等基因或基因組多態(tài)性是酒精性肝硬化發(fā)生、發(fā)展的影響因素,但大部分基因與酒精性肝硬化發(fā)病間的聯(lián)系還有待進(jìn)一步研究。

表1 兩組CTLA-4基因rs4675369位點(diǎn)基因型分布(%)比較

表2 兩組PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)基因型(%)比較

表3 不同CTLA-4基因型肝硬化患者肝功能指標(biāo)(±s)比較

表3 不同CTLA-4基因型肝硬化患者肝功能指標(biāo)(±s)比較

基因型 例數(shù) ALT(U/L) AST(U/L) GGT(U/L) ALP(U/L)AA 型 29 186.0±39.8 130.3±53.3 270.8±87.3 98.8±43.3 AG 型 54 179.4±50.5 127.8±55.2 265.6±90.5 90.2±40.3 GG 型 27 181.8±48.2 133.7±50.4 269.8±89.7 95.2±40.1

表4 不同PNPLA3基因型肝硬化患者肝功能指標(biāo)(±s)比較

表4 不同PNPLA3基因型肝硬化患者肝功能指標(biāo)(±s)比較

基因型 例數(shù) ALT(U/L) AST(U/L) GGT(U/L) ALP(U/L)CC 型 45 182.1±40.8 131.3±51.2 274.8±82.3 97.2±41.4 CG 型 46 180.4±49.1 128.9±55.0 267.1±88.4 91.2±42.2 GG 型 19 180.6±45.2 131.6±52.2 271.2±85.4 94.3±41.1

CTLA-4也被稱為CD152,是T細(xì)胞活化的負(fù)性調(diào)節(jié)分子之一,其基因定位于人2q31-2q33,大小約為4 kb,含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子[7]。CTLA-4胞內(nèi)端存在由36個(gè)氨基酸組成的免疫酪氨酸抑制基序(immune tyrosine inhibitory motif,ITIM)與同源蛋白CD28的免疫酪氨酸激活基序(immune tyrosine activating motif,ITAM)相對(duì)。CTLA-4具有高度內(nèi)吞性,多以同源二聚體形式存在,可在T細(xì)胞活化后協(xié)同CD28等抑制分子共同負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞表達(dá)。生化研究顯示,CTLA-4可為T細(xì)胞受體募集磷酸酶,并減弱其信號(hào),阻滯T細(xì)胞活化。CTLA-4還可從抗原呈遞細(xì)胞膜內(nèi)捕獲、去除B7-1和B7-2,并阻滯其對(duì)CD28的激活能力,最終下調(diào)T細(xì)胞活性。最新研究顯示[8],CTLA-4基因多態(tài)性對(duì)T淋巴細(xì)胞具有不同的抑制程度,GG基因型可顯著減低CTLA-4 mRNA水平,而 AA型可促使 CTLA-4高表達(dá)。CTLA-4基因多態(tài)性還與IgE合成能力密切相關(guān)。AA基因型人群IgE抗體合成能力顯著高于AG或GG型,提示AA基因型或可介導(dǎo)Th2為主的免疫反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)[9],在伴自身免疫性疾病的患者,其GG基因型表達(dá)水平顯著升高,并且患者CTLA-4 mRNA水平較健康人群更高。還有研究發(fā)現(xiàn)[10],CTLA-4外顯子1區(qū)域及其啟動(dòng)子區(qū)域位點(diǎn)多態(tài)性與原發(fā)性膽汁肝硬化的發(fā)生密切相關(guān)。但在本研究中,酒精性肝硬化和健康人CTLA-4基因rs4675369位點(diǎn)基因型和等位基因比率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明CTLA-4基因多態(tài)性與酒精性肝硬化發(fā)生的聯(lián)系還需要研究[11]。本研究血CTLA-4基因rs4675369位點(diǎn)AA型、AG型和GG型的酒精性肝硬化患者血清ALT、AST、GGT和ALP水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明CTLA-4基因多態(tài)性與酒精性肝硬化的臨床關(guān)系也不明。

PNPLA3基因位于人22號(hào)染色體22q13.31處,編碼具有一個(gè)非特異性酰基水解酶活性的非分泌型蛋白[12]。PNPLA3存在一段高度保守的Gly-X-Ser-X-Gly水解序列,其活性中心也位于這一序列內(nèi)[13]。PNPLA3疏水殘基側(cè)鏈底物結(jié)合凹邊緣存在一個(gè)由絲氨酸和天冬氨酸組成的二元體,該二元體是PNPLA3催化效用的重要結(jié)構(gòu)[14]。既往研究顯示[15],PNPLA3基因的非同義序列變異rs738409C＞G是人類肝臟脂肪變性的重要因素,而脂肪變性是酒精性肝硬化患者肝損傷的早期階段,其機(jī)制可能與rs738409的非同義序列變異道甘油三酯活性水解活性被抑制,導(dǎo)致大量甘油三酯堆積于肝細(xì)胞內(nèi)有關(guān),這一機(jī)制也是非酒精性脂肪性肝病的重要發(fā)病機(jī)制[16,17]。此外,PNPLA3的G變異還將導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪分解功能變化,并因此引發(fā)肝組織脂肪堆積[18]。有意思的是,脂肪酸長(zhǎng)度及其類型不同,PNPLA3的反應(yīng)也不同,飽和、單或多不飽和脂肪酸可促使PNPLA3表達(dá)水平上升,而長(zhǎng)鏈脂肪酸則對(duì)PNPLA3表達(dá)無明顯的促進(jìn)作用。有研究發(fā)現(xiàn)[19],PNPLA3還可對(duì)脂肪細(xì)胞表面的特殊位點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié),如PNPLA3變體可抑制甘油三酯在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運(yùn)能力,并增強(qiáng)其脂質(zhì)過氧化的幾率,增強(qiáng)肝臟氧化應(yīng)激水平,并以此介導(dǎo)肝細(xì)胞炎癥和損傷。PNPLA3基因多態(tài)性還可對(duì)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞外的肝臟細(xì)胞數(shù)量和活性發(fā)生作用,并因此引發(fā)肝纖維化,但其機(jī)制尚無確切的結(jié)論。因此,PNPLA3基因多態(tài)性引發(fā)的肝組織脂肪存儲(chǔ)、脂肪變性可作為酒精性肝硬化的高危因素。在本研究中,酒精性肝硬化和健康人PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)基因型和等位基因比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并且肝硬化患者GG基因型和等位基因G比率分別為16.0%和37.5%,佐證了前述的結(jié)論,即提示PNPLA3基因多態(tài)性與酒精性肝硬化的發(fā)生密切相關(guān)。國(guó)外研究顯示[20],PNPLA3基因多態(tài)性與酒精性肝硬化患者肝組織炎癥水平存在一定的相關(guān)性。但本研究發(fā)現(xiàn)酒精性肝硬化患者PNPLA3基因rs738409位點(diǎn)CC型、CG型和GG型患者血清ALT、AST、GGT和ALP比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明PNPLA3基因多態(tài)性與酒精性肝硬化患者的病情無顯著關(guān)系,可能與本組研究樣本數(shù)量較少有關(guān)。此外,本研究所取樣本為血清,并未進(jìn)行肝臟穿刺活檢取樣,或?qū)⒀谏w了一些信息。

本研究通過基因分析,發(fā)現(xiàn)PNPLA3基因多態(tài)性可導(dǎo)致肝組織脂肪存儲(chǔ)或脂肪變性等病理學(xué)改變,最終參與酒精性肝硬化的發(fā)生和發(fā)展,而CTLA-4基因多態(tài)性則與酒精性肝硬化發(fā)病無明顯的關(guān)系。由于本研究例數(shù)較少,還存在一些不足,有待我們今后進(jìn)行多中心、大樣本的研究證實(shí)。PNPLA3基因多態(tài)性與酒精性肝硬化發(fā)病的確切關(guān)系,尚需進(jìn)一步研究。