云南省不同森林土壤中三七促生拮抗細菌的分離篩選

鄧琳梅　楊蕾　張俊星　字變仙　龔加壽　梅馨月　劉屹湘　朱書生　楊敏

摘要：【目的】明確云南省不同森林類型林下土壤是否適宜種植三七，篩選森林土壤中對三七主要病原菌具有拮抗作用的生防細菌資源，為三七林下種植及病害的生物防治提供理論依據。【方法】收集不同森林類型（雜木林、思茅松林、云南松林和桉樹林）土壤浸提液，比較過濾液（除去微生物）和未過濾液對三七種子出苗及生長的影響;以連作土為對照，分析添加10%林下土壤對連作土中三七種子萌發和幼苗單株鮮重的影響。利用LB平板分離法分離森林土壤中的可培養細菌，通過對峙培養法篩選對三七病原菌具有拮抗活性的菌株，并選取對三七主要病原菌均具有拮抗活性的菌株進行16S rDNA分類鑒定。【結果】與過濾液相比，云南松林和思茅松林土壤浸提未過濾液可促進三七種子萌發和幼苗生長;雜木林土壤浸提未過濾液可促進三七種子萌發，但對幼苗生長有一定的抑制作用;桉樹林土壤浸提未過濾液對三七種子萌發和幼苗生長均具有一定的抑制作用。在連作土中添加10%松林土壤可有效緩解三七連作障礙;添加雜木林和桉樹林土壤對三七種子萌發有抑制作用，但可在一定程度上促進三七幼苗生長。從森林土壤中共分離獲得465株細菌，其中分離自松林土壤中的14株細菌對供試三七主要病原菌均具有較強的拮抗活性，包括6株芽孢桿菌屬、5株鏈霉菌屬、2株假單胞菌屬和1株腸桿菌屬，抑菌活性在58.02%～98.61%。【結論】松樹林尤其是思茅松林土壤中存在大量的有益微生物，且這些有益微生物既能抑制根腐病菌，減輕三七連作障礙，又能促進三七種子萌發和幼苗生長。

關鍵詞： 三七;連作障礙;促生細菌;拮抗細菌;林下種植;云南省

中圖分類號： S435.672? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）01-0115-08

Abstract：【Objective】To explore whether different forest soils in Yunnan Province was suitable for planting Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen， and screen bacterial strains with growth-promoting and pathogen antagonistic effects on P. notoginseng， and provide theoretical basis for under forest planting of P. notoginseng and biological control of P. notoginseng disease. 【Method】The different forest soils extracts（miscellaneous wood forest，Simao pine forest，Yunnan pine forest and eucalyptus forest） were collected to compare the effects of forest soil filtrate（removed microbes） and non-filtrate on seed germination and seedling growth of P. notoginseng. The alleviation effects of 10% forest soil amendment on P. notoginseng seed germination and seedling fresh weight was analyzed using consecutively cultivated soil as control. The bacterial strains were isolated from soils by LB plate dilution method， the strains with inhibition activity against P. notoginseng pathogens were screened by confrontation culture method and the antagonistic isolates were identified by 16s rDNA. 【Result】The results showed that pine and miscellaneous forest water non-filtrated extracts could promote seed germination and seedling growth compared， the non filtrate of miscellaneous forest could promote the seed germination of P. notoginseng， but inhibited the growth of seedlings. The non filtrate of eucalyptus forest could inhibit the seed germination and seedling growth of P. notoginseng. 10% pine soil amendment obviously reduced the adverse effect of replant failure of P. notoginseng. The addition of miscellaneous forest soil and eucalyptus forest soil inhibited the germination of P. notoginseng seeds， but promoted the growth of P. notoginseng seedlings to a certain extent. A total of 465 bacterial strains were isola-ted from forest soils， and 14 strains isolated from pine soil showed strong antifungal activity against main pathogens of P. notoginseng， including six Bacillus isolates， five Streptomyces isolates， two Pseudomonas isolates and one Lelliottia isolate， the colony inhibition rate was 58.02%-98.61%. 【Conclusion】There may exist plenty of antagonistic and plant growth promoting bacteria resource in pine soil especially Simao pine soil. These beneficial microorganisms can not only inhibit the root rot pathogen and reduce the continuous cropping obstacle of P. notoginseng， but also promote the seed germination and seedling growth of P. notoginseng.

Key words： Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen; replant obstacle; plant-growth promoting bacteria; antagonistic bacteria; under forest planting; Yunnan

Foundation item：National Natural Science Foundation of China（31772404）;National Key Research? Program（2017YFC1702502）;Yunnan Middle-aged and Young Personnel Project（2017HB024）

0 引言

【研究意義】三七[Panax notoginseng （Burk.） F.H. Chen]為五加科人參屬名貴中藥材，以干燥的根、根狀莖入藥，具有活血化瘀、消腫定痛等功效（陳紅艷等，2019）。近年來，由于連年大面積單一種植，三七生產出現連作障礙問題，已嚴重影響其產量和品質。目前，生產上主要通過化學農藥和輪作倒茬來緩解三七連作障礙，但農藥的大量使用不但未明顯減輕連作障礙，反而導致嚴重的農藥殘留問題。輪作能較好地克服連作障礙，但三七輪作周期長，一般種植后要經過10年以上的輪作才能再次種植（簡在友等，2009）。云南是三七的主產地和原產地，隨著市場對三七需求量的不斷增加和新墾地的減少，三七種植逐漸從道地產區向非道地產區轉移，嚴重影響三七藥材的道地性和原產地保護。云南省森林資源豐富，充分利用林地資源開展林下三七生態種植，一方面可有效解決由于三七連作障礙帶來的無農田地可種的困境，另一方面有利于三七品質和藥效的提升，有利于實現三七產業的可持續發展。【前人研究進展】林下中藥材種植是將適宜林下生長的藥用植物引種到自然環境下進行野生化栽培，在充分利用林地資源的同時節約了大量農田，且保證中藥材質量，是一種科學合理的生態種植模式。目前人參林下種植技術已較成熟，許多學者從不同人參種植基地的種植條件、林下人參種植品種及林地選擇等方面入手，結合多年的實踐歸納總結出一套林下人參種植技術要點：適宜的生長環境、優良的品種和種植區的合理規劃（齊淑艷，2006;王婷婷等，2014;甄廣韻，2017）。三七的林下種植也有學者進行了積極探索。姜成厚等（2012）在廣西梧州進行三七林下種植試驗，結果表明在梧州地區具有可行性，可以推廣種植。Gong等（2016）在湖南對不同林下三七栽培技術進行研究，結果表明杉木林、核桃等林下環境適宜種植三七。云南省現有林業用地面積高達2500萬ha，而在思茅松林地、云南松林地、桉樹林地及雜木林地等主要林地類型中是否適宜種植三七目前尚未見報道。焦如珍等（1997）研究表明，土壤微生物、酶和養分是森林生態系統的重要組成部分，土壤微生物通過分解植物殘體而參與森林生態系統的能量流動和物質循環，是土壤肥力的重要指標。森林土壤微生物積極參與氮、磷、鉀等營養物質的地球化學循環，將有機質分解為植物可吸收利用的形態，土壤微生物還產生大量生物活性物質，直接關系到植物的生長（王慧敏，2009）。吳慶梅等（2009）研究表明，森林類型會對林下土壤微生物的促生菌總量和比例造成一定影響。【本研究切入點】植物—土壤微生物間的相互作用很早就為人們所關注，土壤微生物是陸地生態系統的主要活性組分，在土壤有機質分解、養分循環和生態系統穩定中發揮著關鍵作用。土壤中細菌群落是土壤微生物中數量最多、分布最廣且多樣性最豐富的類群之一，目前森林土壤中是否存在對三七生長具有促進作用且能抑制三七主要病害的細菌類群鮮見相關報道。【擬解決的關鍵問題】從云南省不同森林類型入手，評價不同森林類型土壤浸提液對三七生長的影響及引入后對三七連作障礙的緩解作用，在此基礎上分離篩選對三七生長具有促進作用且能抑制三七主要病害的微生物資源，以明確云南適宜種植三七的森林資源類型，并進一步擴大生防菌種資源庫，為三七病害生防菌劑的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 培養基 LB培養基（蛋白胨10.0 g、酵母浸粉5.0 g、氯化鈉10.0 g、瓊脂粉18.0 g，用去離子水定容至1000 mL）用于土壤細菌分離;NA培養基（牛肉浸粉3.0 g、蛋白胨5.0 g、葡萄糖2.5 g、瓊脂粉18.0 g，用去離子水定容至1000 mL）用于土壤細菌保存;PDA培養基（馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂粉18.0 g，用去離子水定容至1000 mL）用于病原真菌培養和拮抗菌篩選。

1. 1. 2 三七病原菌 惡疫霉菌（Phytophthora cactorum）D-1、人參鏈格孢菌（Alternaria panax）AP-2、毀滅柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）RS006和茄腐鐮刀菌（Fusarium solani）F3均由云南農業大學農業生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室提供并經過致病性測定。

1. 1. 3 土樣 分別采自云南省西雙版納的雜木林土（ZM）;寧洱（S1）和瀾滄（S2，S3）的思茅松林土;建水（Y1）、文山（Y2，Y3）、迪慶（Y4）和麗江（Y5）的云南松林土;瀾滄的桉樹林土（An）;云南文山的三七連作土（L）。取土時以S形取樣法分別選取5個樣點，去除表面枯枝落葉等雜物后采集0～20 cm土壤樣品，混合均勻后低溫運回實驗室，于4 ℃冰箱保存備用。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 土壤理化性質測定 林下土壤有效養分采用常規農化分析方法測定（鮑士旦，2000）。土壤有機質含量采用高溫外熱重鉻酸鉀氧化—容量法測定，堿解氮含量采用堿解擴散法測定，速效鉀含量采用乙酸銨浸提—火焰光度計法測定，有效磷采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測定，電導率采用電導率儀（MP513型，上海三信儀表廠）測定，pH采用精密pH計（MP512型，上海三信儀表廠）測定。

1. 2. 2 森林土壤浸提液種植三七效果評價 取采自不同地點的林下土壤過0.84 mm（20目）篩后在體積500 mL的三角瓶中用無菌水（按林下土壤和無菌水體積比1∶10的比例）浸泡，將三角瓶置于搖床上，25 ℃、150 r/min振蕩24 h，經定性濾紙（20 μm）過濾收集土壤浸提液。將收集到的土壤浸提液分為兩份，一份用0.22 μm濾膜過濾除去微生物（只含有養分），另一份不過濾處理（含有養分和微生物）。

為明確土壤微生物的作用，進行林下土壤浸提液對三七種子萌發和幼苗生長影響試驗。選取飽滿的三七種子，用1.5% NaClO表面消毒5 min，無菌水沖洗3次。石英砂經160 ℃高溫干熱滅菌3 h，稱取100 g加入滅菌組培瓶（250 mL）內備用。添加石英砂的組培瓶分為兩組，第一組加入未過濾的土壤浸提液;第二組加入過濾的土壤浸提液，每瓶加入浸提液20～25 mL ，在每個組培瓶中放入15粒三七種子，蓋好瓶蓋。每處理4次重復，按隨機區組擺放于晝夜溫度24 ℃/16 ℃、光照強度2000 lx、12 h光暗交替的生長間中培養，60 d后調查出苗率，75 d后稱量植株整株鮮重。

1. 2. 3 連作土摻入森林土壤種植三七效果評價

為明確土壤微生物是否具有緩解三七連作障礙的作用，于三七連作土中混合拌入10%的供試森林土壤，在引入土壤微生物的同時避免改變土壤理化性質（Weller et al.，2002）。將連作土和供試土樣按9∶1的比例混合均勻后裝入組培瓶中，加入20 mL無菌水，在每個組培瓶中放入15粒三七種子并置于1.2.2的生長間進行培養。每處理6次重復，以未加入供試森林土壤的三七連作土為對照，60 d后調查出苗率，75 d后稱量整株鮮重。

1. 2. 4 供試森林土壤中可培養細菌分離 采用稀釋平板法對供試土壤中的細菌進行分離。取10 g土樣加入100 mL無菌水，120 r/min振蕩30 min后靜置20 min，制成土壤菌懸液;用無菌水將土壤菌懸液稀釋至10-2、10-3和10-4，取100 ?L加入到LB培養基表面，涂布均勻后置于28 ℃恒溫培養箱中培養;待細菌菌落長出，挑取不同形態的單菌落進行純培養，得到純菌落后接種至NA培養基斜面上，4 ℃保存備用。

1. 2. 5 拮抗細菌篩選 采用平板對峙法篩選拮抗細菌分離物。將供試三七病原菌用打孔器制成直徑5 mm的菌餅接種于PDA培養基中央，在與其距離2.2 cm的位置對稱接種4株相同的細菌分離物，于28 ℃恒溫培養箱培養。每處理4次重復，以只接病原菌的PDA培養基為對照。待對照菌落長至培養皿的2/3時，觀察是否出現抑菌圈，篩選對三七主要病原菌具有拮抗活性的細菌分離物，并采用十字交叉法測量菌落半徑，計算抑菌率。

抑菌率（%）=（對照菌落半徑-對峙培養菌落

半徑）/對照菌落半徑×100

1. 2. 6 拮抗細菌鑒定 對1.2.5中篩選獲得的對三七主要供試病原菌均具有拮抗活性的細菌進行16S rDNA鑒定。采用細菌DNA提取試劑盒（昆明碩陽科技有限公司）提取拮抗細菌的基因組DNA。利用細菌16S rDNA通用引物（27F：5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3';1492R：5'-TACGGCTACCTTG TTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR反應體系（50.0 μL）：2×PCR Taq MasterMix 25.0 μL，DNA模板2.0 μL，上、下游引物各2.0 μL，無菌去離子水19.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性4 min;94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環;72 ℃延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至昆明碩陽科技有限公司進行測序。利用BLAST將獲得的16S rDNA序列在NCBI數據庫中進行同源性比對，選取相似度高的種屬確定分離菌株的分類地位。

1. 3 統計分析

利用 Excel 2013進行數據處理，并用SPSS 19.0 進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結果與分析

2. 1 不同森林類型土壤有效養分總體特征

供試土壤樣品采自云南省海拔1310～3290 m的區域，其理化性質見表1。由表1可知，供試土壤樣品電導率50.2～156.5 μS/cm、pH 5.1～6.8、有機質含量8.9～107.5 g/kg、堿解氮含量109.4～497.9 mg/kg、有效磷含量3.7～63.3 mg/kg、速效鉀含量92.1～404.7 mg/kg。土壤電導率和pH反映土壤的鹽堿化程度，有機質含量和土壤有效磷含量分別與土壤肥力和土壤中磷循環密切相關，土壤堿解氮含量和速效鉀含量反映土壤氮素和速效鉀的供應狀況。總體而言，種植三七的連作土由于施肥的原因，其有效磷、速效鉀含量和電導率普遍高于森林土壤。

2. 2 森林土壤浸提液種植三七的效果評價

由表2可看出，以云南松林和雜木林土壤浸提未過濾液處理三七種子后，其萌發率均高于過濾處理;思茅松林處理中除S3處理外，其他處理均高于過濾處理;桉樹林處理中未過濾處理的種子萌發率略低于過濾處理。在單株鮮重方面，大多數區域的云南松林和思茅松土壤浸提未過濾液處理有利于增加三七幼苗的鮮重，而雜木林和桉樹林土壤浸提未過濾處理對三七幼苗生長有一定的抑制作用。由此可看出，云南松林和思茅松林土壤中含有促進三七種子萌發和幼苗生長的微生物，桉樹林土壤中的微生物可能不適宜三七生長。雜木林由于采樣點較少，其土壤微生物是否適宜三七生長還有待進一步探究。

2. 3 連作土摻入森林土壤種植三七的效果評價

由表3可看出，在三七連作土中摻入10%森林土壤后，思茅松林的土壤微生物可明顯促進連作土中三七種子萌發和幼苗生長，尤其是采自寧洱的森林土壤對三七種子萌發和單株鮮重具有顯著的促進作用（P<0.05）。云南松林土壤對三七連作障礙具有一定的緩解作用，2個采樣點的土壤可促進三七種子萌發，4個采樣點的土壤可明顯促進三七幼苗生長，只有采自麗江的云南松林土壤對三七連作障礙無緩解作用，甚至還抑制了三七的出苗和生長。雜木林和桉樹林土壤的引入具有類似效果，即對三七種子萌發有抑制作用，但可在一定程度上促進三七幼苗生長。表明思茅松和部分區域的云南松林土壤中含有可緩解三七連作障礙的微生物。桉樹林和雜木林由于采樣點較少，其土壤微生物是否具有緩解三七連作障礙的效應還有待進一步探究。

2. 4 拮抗細菌的分離及其對三七主要病原菌的拮抗作用

利用平板分離法從供試森林土壤中共分離獲得465株細菌分離株。平板對峙結果（表4）顯示，52株分離株對三七病原菌具有拮抗作用，其中16株分離株分離自云南松林土壤，36株分離自思茅松林土壤，供試雜木林和桉樹林土壤中均未分離到拮抗菌株;分離獲得的52株拮抗菌株中，40株分離株對惡疫霉菌（D-1）具有明顯的拮抗活性，15株對茄腐鐮刀菌（F3）具有明顯的拮抗活性，19株對毀滅柱孢菌（RS006）具有明顯的拮抗活性，38株對人參鏈格孢菌（AP-2）具有拮抗活性。有14株分離菌株對供試三七病原菌均表現抑制活性，抑制率在58.02%～98.61%，其中有3株分離自云南松林土壤，11株分離自思茅松林土壤。各分離菌株的抑菌活性差異明顯，其中拮抗細菌S291和NE171對惡疫霉菌的抑制率最高，達98.61%;拮抗細菌9042對茄腐鐮刀菌的抑制率最高，為79.63%;拮抗細菌9042對毀滅柱孢菌的抑制率最高，為87.35%;拮抗細菌10111對人參鏈格孢菌的抑制率最高，為95.52%。

2. 5 拮抗細菌的分子鑒定結果

選取對三七主要病原菌均具有拮抗活性的14株分離菌株進行16S rDNA鑒定。將測序得到的14株拮抗菌株的16S rDNA序列輸入GenBank數據庫中進行BLAST比對分析，結果（表5）發現有6株為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、5株鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）、2株假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、1株腸桿菌屬（Lelliottia sp.）。云南松林土中分離鑒定的3株拮抗細菌分屬于暹羅芽孢桿菌（B. siamensis）、銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）和腸桿菌屬;思茅松林土壤中分離獲得11株拮抗細菌，包括1株玫瑰色鏈霉菌（Streptomyces roseus）、2株龜裂鏈霉菌（S. rimosus）、1株生靛鏈霉菌（S. indigoferus）、1株津島鏈霉菌（S. tsukiyonensis）、1株銅綠假單胞菌、1株蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）、3株枯草芽孢桿菌（B. subtilis）和1株解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。由此可看出，思茅松林土壤中拮抗菌的比例更高，尤其是瀾滄地區的思茅松林土壤中含有的拮抗微生物資源更豐富，且以芽孢桿菌居多，占45.5%。

3 討論

本研究結果表明，森林土壤微生物群落可改良三七連作土，有效緩解三七連作障礙。對不同森林土壤微生物比較分析結果表明，與桉樹林及雜木林相比，松林土壤中含有更多適宜三七種子萌發和幼苗生長的有益微生物，因此，松樹林更適宜開展林下三七種植。但林下環境復雜，森林中溫度和光照等自然條件對三七的影響還需進一步研究，才能構建完善的林下三七種植體系。

在植物根際界面上，植物、土壤和微生物是一個不可分割的整體，三者間具有很強的依賴性，所涉及的生物化學過程也非常復雜，然而，已有的大部分研究只針對單一對象進行分析，所得到的結論不能全面反映該對象在整個根際過程中的作用和地位（艾超等，2015）。土傳病害的流行、連作障礙的出現，其主要原因在于土壤微生物群落結構失衡而導致微生態環境惡化（龔明福等，2007），目前國際上通過構建土壤微生物群落多樣性來防治植物病害和提高土壤抑病性的研究已成為植物病害生物防治領域的研究熱點（段永照等，2010）。本研究供試的10份森林土壤理化性質良好，土壤浸提液試驗結果表明，含有益微生物的土壤浸提液有利于促進三七種子萌發和幼苗生長;未過濾處理下，添加思茅松林土壤浸提液后三七種子萌發率整體高于云南松林土壤浸提液處理，而云南松林土壤浸提液處理更有利于三七幼苗生長，其鮮重整體高于思茅松林土壤浸提液處理。在石英砂中加入未過濾的桉樹林土壤浸提液后，三七單株鮮重及萌發率明顯低于其他森林土壤浸提液處理，可能是由于桉樹林土壤中的化感物質會抑制三七生長（郝建等，2011）。將林下土壤摻入三七連作土后，桉樹林和雜木林土壤對三七連作障礙無明顯緩解作用，添加思茅松林土壤后三七的萌發率及單株鮮重整體高于云南松林處理，可能是由于思茅松林土壤中拮抗微生物更豐富，因此引入到連作土后可有效抑制三七主要病原菌，從而促進三七生長，有效緩解三七連作障礙。

本研究的森林土壤拮抗細菌分離結果顯示，共獲得52株拮抗細菌，其中36株分離自思茅松林土，16株分離自云南松林土，桉樹林和雜木林中未分離到拮抗微生物，與引入森林土壤緩解三七連作障礙的結論一致。已有研究表明，通過添加0.1%～10.0%的林下土壤，可在不改變原有土壤理化性質的前提下將防病微生物轉移到本底土壤中（Mendes et al.，2011），因此本課題組嘗試將林下土壤中具有抑菌功能的不同微生物群落引入到三七連作土中，發現普遍可提高三七鮮重和萌發率，使連作土壤微生物區系得到改善（另文報道），為緩解三七連作障礙提供了新思路。

從松林土壤中分離獲得的拮抗微生物可有效抑制三七主要病原菌的生長，抑制率在58.02%～98.61%，其主要種類為鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬，占總數的78.57%，分離到的拮抗細菌均來源于云南省不同區域的松林土壤中，為后續在松林下進行三七種植提供了重要的依據。鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬是廣泛存在于自然界中重要的生物防治微生物資源，芽孢桿菌可通過產生低分子抗生素及蛋白或多肽類化合物對許多病原真菌表現出較強的抑制活性（趙新林和趙思峰，2011;陳哲等，2015;趙昱榕等，2019）;鏈霉菌主要通過拮抗作用、競爭作用、重寄生作用和誘導抗性作用等抗病機制防治植物土傳病害，且鏈霉菌可通過多種方式聯合發揮生防作用（毛良居和毛赫，2017）。但拮抗細菌的田間防治效果評價及不同生防菌間的菌群組合增效技術還需進一步研究。

4 結論

松樹林土壤浸提液可促進三七種子萌發和生長，在松林尤其是思茅松林土壤中分離到大量的有益微生物，包括芽孢桿菌、鏈霉菌、假單胞菌和腸桿菌，這些微生物既能抑制根腐病菌，減輕三七連作障礙，又能促進三七種子萌發和幼苗生長。

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（責任編輯 麻小燕）