基于SRAP分子標記的貴州省棕櫚種質資源遺傳多樣性分析

毛躍雄　陸躍堂　胡志姣　趙楊

摘要：【目的】研究貴州省棕櫚資源的遺傳多樣性及遺傳結構，揭示其分布格局與變異趨勢，為貴州省棕櫚種質資源保護及開發利用提供科學依據。【方法】基于SRAP分子標記對貴州省7個農業氣候區的26個棕櫚種源328份材料進行擴增，經Qsep 100全自動核酸蛋白分析儀電泳分析后，利用Popgene 1.32和NTSYS-pc 2.1計算主要遺傳多樣性參數及進行種源聚類分析。【結果】貴州省棕櫚遺傳多樣性豐富，其種級水平上的多態性條帶百分率（PPB）為97.31%，觀測等位基因數（Na）為1.9731、有效等位基因數（Ne）為1.4717、Nei?s基因多樣度（H）為0.2689、Shannon?s信息指數（I）為0.4212，但在種源水平上遺傳多樣性差異明顯。貴州省26個棕櫚種源間的遺傳分化系數（Gst）為0.3305，即種源內變異是貴州省棕櫚資源遺傳變異的主要來源。UPGMA聚類分析結果顯示，在閾值為0.91時，26個棕櫚種源可分成四大類，其遺傳分化與地理環境有一定相關性。Mantel檢驗結果顯示，貴州省棕櫚資源遺傳分化與其地理距離呈正相關（r=0.2651），但相關性不顯著（P>0.05）。貴州省7個農業氣候區內的棕櫚資源基因流（Nm）均大于貴州省棕櫚種源Nm（1.0129），說明小區域內的棕櫚資源基因交流頻繁。【結論】貴州省棕櫚種質資源總體遺傳多樣性高，種源間分化較明顯，選擇育種潛力巨大。為更好地開發利用棕櫚資源，應結合其遺傳結構特點，實行就地保護為主及建設種質資源庫為補充的保護策略。

關鍵詞： 棕櫚;SRAP分子標志;遺傳多樣性;遺傳分化;空間分布格局;貴州省

中圖分類號： S792.91? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）01-0027-09

Abstract：【Objective】The study on genetic diversity and genetic structure of Trachycarpus fortunei（Hook.） H. Wendl resources in Guizhou， revealed its distribution pattern and variation trend，and provided scientific basis for the protection， development and utilization of T. fortunei germplasm resources in Guizhou. 【Method】Based on SRAP molecular markers， 328 materials from 26 T. fortunei provenances in 7 agroclimatic regions of Guizhou were amplified. After electrophoresis analysis by Qsep 100 automatic nucleic acid protein analyzer， Popgene 1.32 and NTSYS-pc 2.1 were used to calculate the main genetic diversity parameters and perform the provenances clustering analysis. 【Result】The genetic diversity of T. fortunei in Guizhou was rich， the percentage of polymorphic bands（PPB） was 97.31% at species level， the observed alleles（Na） was 1.9731，? effective alleles（Ne） was 1.4717， Neis gene diversity index（H） was 0.2689， and Shannons information index（I） was 0.4212， but there were significant differences in genetic diversity at the provenance level. The genetic diversity（Dst） among the 26 T. fortunei provenances in Guizhou was 0.3305， which revealed that intra-provenance variation was the main source of genetic variation of T. fortunei resources in Guizhou. The UPGMA cluster analysis showed that the 26 T. fortunei provenances could be divided into four categories at the threshold of 0.91， and their genetic differentiation was related to the geographical environment. The Mantel test showed that there was a positive correlation between genetic differentiation and geographical distance（r=0.2651） in Guizhou，but the correlation was not significant（P>0.05）. The gene flow（Nm） of T. fortunei resources in seven agroclimatic regions of Guizhou was larger than that of T. fortunei species in Guizhou（1.0129）， indicated that gene exchange of T. fortunei resources was frequent in small areas. 【Conclusion】 T. fortunei germplasm resources of Guizhou have high genetic diversity， large differentiation between provenances， and huge potential of selection and breeding. In order to exploit and utilize T. fortunei resources better， combi-ning with its genetic structure characteristics， the conservation strategy is put forward， which is mainly in situ conservation and supplemented by the construction of germplasm resource bank.

Key words： Trachycarpus fortunei（Hook.） H. Wendl;SRAP molecular marker; genetic diversity; genetic differentia-tion; spatial distribution pattern; Guizhou

Foundation item： Guizhou Major Scientific and Technological Project（Qiankehezhongdazhuanxiang〔2014〕6024-1）

0 引言

【研究意義】棕櫚[Trachycarpus fortunei（Hook.） H. Wendl]是貴州省的常見鄉土樹種，隸屬于棕櫚科（Palmae）貝葉棕亞科（Coryphoideae）棕櫚屬（Trachycarpus），全樹均可開發利用，其產品多元、用途廣泛（舒迎瀾，2004;董云發，2005;衛強和王燕紅，2016），且具有淺根性及宜石灰土等特性，是改善石漠化生態環境的優良經濟樹種（但新球等，2003）。棕櫚在貴州省分布廣泛，但天然林破壞嚴重，居群呈零星分布，多為野生或半野生狀態，利用效率不高。采用分子標記技術研究物種遺傳多樣性和遺傳結構特征，可為其種質資源保護、遺傳改良及開發利用提供科學依據（凌士鵬等，2018;馮建燦等，2019），因此，加強貴州省棕櫚種質資源遺傳多樣性研究，對促進貴州省棕櫚產業發展及石漠化生態修復樹種選擇均具有重要意義。【前人研究進展】至今，已有專家學者分別使用RAPD、AFLP、SRAP、ISSR和SSR等分子標記在多種棕櫚科植物上開展了種質資源遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建及系統進化關系等相關研究工作（Ohtani et al.，2009;周麗霞和曹紅星，2018），包括油棕（Hayati et al.，2004;丁燦等，2011;肖勇等，2013）、山棕（賈春媛，2009）、董棕（趙春磊，2009）、檳榔（任軍方，2010）、椰子（Rajesh et al.，2015;Geethanjali et al.，2018）、蒲葵（Kondo et al.，2017）等，但針對棕櫚遺傳多樣性的研究較少。楊華（2005）利用RAPD分子標記與表型測定對黃藤和單葉省藤天然種群進行遺傳多樣性分析，結果證實種群內變異是其遺傳變異的主要原因。安琪等（2010）采用AFLP分子標記對云南省境內的11種棕櫚藤親緣關系進行分析，結果顯示云南省棕櫚藤遺傳多樣性豐富，各品種間的遺傳分化程度較高，且發現原始省藤亞屬和省藤亞屬兩個亞屬物種互相交叉滲透。Rajesh等（2015）采用SCoT分子標記評估全球23個椰子種質遺傳多樣性，進一步證實了SCoT分子標記用于物種遺傳多樣性分析的可行性。Kondo等（2017）利用20對SSR分子標記對日本的6個蒲葵群體進行遺傳多樣性分析，其結果為揭示蒲葵偏遠種群的起源提供了依據。Geethanjali等（2018）以48對SSR分子標記分析世界范圍內79種椰子種質的遺傳多樣性和種群結構，結果發現其遺傳多樣性較高，分層聚類為兩大聚類，與其地理起源相對應。在棕櫚種質資源遺傳多樣性研究方面，李文表（2005）利用ISSR分子標記分析了云南、廣西和湖南3個分布區的棕櫚遺傳多樣性，胡志姣和趙楊（2018）從形態學角度對貴州省棕櫚種源遺傳多樣性進行了研究。【本研究切入點】SRAP分子標記具有多態性高、重復性好、操作簡便及成本較低等優點，已廣泛應用于觀賞植物（盧超等，2014;邱帥等，2018;馬秀花等，2019）、藥用植物（陳大霞等，2018;潘綠昌等，2018）、糧食作物（龐新華等，2019;張明飛等，2019;趙小慶等，2019）等植物種質資源鑒定評價，但至今未見應用于棕櫚種質資源研究領域。【擬解決的關鍵問題】從已發表的不同植物SRAP分子標記引物中篩選出多態性引物，對貴州省26個棕櫚種源328份材料進行擴增，經Qsep 100全自動核酸蛋白分析儀電泳分析后，利用Popgene 1.32和NTSYS-pc 2.1計算主要遺傳多樣性參數及進行種源聚類分析，旨在揭示貴州省棕櫚的分布格局與變異趨勢，為其種質資源保護及開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

從黔東北部（溫暖伏旱區）、黔東南部（溫暖濕潤區）、黔北部（溫和伏旱區）、黔中部（溫和濕潤區）、黔西南部（溫和春干夏雨區）、黔南部（溫熱春干區）及黔西部（溫涼春干區）等7個農業氣候區選取26個棕櫚種源328份材料，所選樣株均為野生資源，樹齡在20年左右，單株距離在50 m以上。分別采集生長良好、無病蟲害的當年生嫩葉，經硅膠干燥、液氮速凍后帶回實驗室，-80 ℃保存備用。利用GPS定位樣品采集地的地理坐標，具體采樣情況及種源地生態條件如表1所示。主要試劑：新型植物DNA提取試劑盒（DP320）、D2000 DNA Marker（MD114）和2×Taq PCR MasterMix（KT201）均購自天根生化科技（北京）有限公司。主要儀器設備：BioPhotometer Plus核酸蛋白定量檢測儀（德國Eppendorf公司），BIO-RAD T100 PCR儀（美國Bio-Rad公司），Tanon 1600凝膠成像系統（上海天能科技有限公司），Qsep 100全自動核酸蛋白分析儀（中國臺灣光鼎生物科技股份有限公司）。

1. 2 DNA提取

將采集的材料取出并迅速剪碎，置于盛有液氮的無菌研缽中研磨至粉末狀，然后按新型植物DNA提取試劑盒說明提取棕櫚總DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和BioPhotometer Plus核酸蛋白定量檢測儀進行檢測，合格的棕櫚總DNA以TE稀釋標定至100 ng/μL，-20 ℃保存備用。

1. 3 SRAP反應體系建立

從已發表的不同植物SRAP分子標記引物序列（李曉慧等，2007;李梅等，2009;劉倩，2013;林方養等，2014）中篩選出正向引物17條、反向引物18條，形成306對SRAP引物組合，委托北京全式金生物技術有限公司合成。利用4個種質材料對SRAP引物組合進行復篩，選出擴增條帶清晰穩定、多態性豐富、重復性好的引物組合（表2）。優化后的SRAP反應體系20.0 ?L：DNA模板2.0 ?L，上、下游引物（10 ?mol/L）各0.5 ?L，2×Taq PCR MasterMix 10.0 ?L，ddH2O 7.0 ?L。參照林方養（2014）的SRAP擴增程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃ 30 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，進行5個循環;94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，進行35個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1. 4 擴增產物檢測與分析

SRAP擴增產物直接利用Qsep 100全自動核酸蛋白分析儀進行分析，全自動進樣，無須人工制膠、灌膠、上樣、拍照，免去手工制膠的繁瑣和人工上樣的誤差，產物長度（bp）可直接讀出并根據需要選擇呈現信號峰值圖或模擬電泳圖。根據模擬電泳結果，對不同材料在同一位點的擴增片段進行統計，條帶清晰明亮記為“1”，無條帶或模糊記為“0”，生成0-1矩陣。轉換相應的數據格式后，用Popgene 1.32計算多態性條帶百分率（PPB）、觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Nei?s基因多樣度（H）、Shannon?s信息指數（I）、遺傳一致度（In）、遺傳距離（D）、總基因多樣性（Ht）、種源內基因多樣性（Hs）、種源間的遺傳分化系數（Gst）及基因流（Nm）等主要遺傳多樣性參數，并采用NTSYS-pc 2.1按照UPGMA法進行種源聚類分析。根據采樣點地理坐標信息計算各樣點間的地理距離，使用TFPGA 1.3對遺傳距離和地理距離進行Mantel檢驗;利用PASW Statistics v18.0分析遺傳多樣性與種源地生態條件線性相關性，探索遺傳多樣性空間分布格局。

2 結果與分析

2. 1 SRAP多態性分析結果

10對SRAP引物組合共擴增得到260條目的條帶，且擴增條帶清晰穩定（圖1），其中多態性條帶253條（平均25.3條），PPB為97.31%（表3）。以Me4-Em5引物組合的PPB最低，為88.00%;有7對SRAP引物組合（Me1-Em2、Me2-Em1、Me3-Em1、Me3-Em4、Me4-Em4、Me5-Em2和Me6-Em5）的PPB達100.00%。說明這10對SRAP引物組合能穩定高效地檢測棕櫚資源遺傳多樣性，為核心種質篩選提供依據。

2. 2 棕櫚遺傳多樣性評價及空間分布格局分析結果

26個棕櫚種源的遺傳多樣性參數統計結果如表4所示。其中，PPB在31.92%（YJ）～79.62%（NY），平均為61.15%;Na在1.3192（YJ）～1.7962（NY），平均為1.6112;Ne在1.1809（SQ）～1.3678（NY），平均為1.2975;H在0.1136（SQ）～0.2292（NY），平均為0.1809;I在0.1741（YJ）～0.3571（NY），平均為0.2790。26個棕櫚種源間的遺傳多樣性差異明顯，納雍（NY）、貴定（GD）、六枝（LZ）、貴陽（GY）和湄潭（MT）等種源的遺傳多樣性較豐富，而印江（YJ）、石阡（SQ）和劍河（JH）等種源的遺傳多樣性較低。貴州省棕櫚種級水平的PPB為97.31%、Na為1.9731、Ne為1.4717、H為0.2689、I為0.4212，說明貴州省棕櫚遺傳多樣性豐富。

由表5可知，各農業氣候區棕櫚居群的遺傳多樣性存在明顯差異，其中，黔中（溫和濕潤）農業氣候區的多態性條帶最多（250條），PPB高達96.15%，對應的Na、Ne、H、I分別為1.9615、1.3946、0.2470和0.3895，均較高;黔東北（溫暖伏旱）農業氣候區的多態性條帶最少（171條），PPB僅為65.77%，對應的Na、Ne、H、I分別為1.6577、1.2683、0.1697和0.2680，均最低。

棕櫚主要遺傳多樣性參數與種源地生態條件的相關性分析結果（表6）顯示，PPB、H和I與年均氣溫、無霜期均呈負相關，與年均降水量呈正相關，但相關性均不顯著（P>0.05，下同）。PPB與海拔呈正相關，但相關性不顯著;I和H與海拔呈顯著正相關（P<0.05，下同），表明海拔對貴州省棕櫚的遺傳多樣性分布有顯著影響。

2. 3 棕櫚居群的聚類分析結果

基于遺傳一致性的UPGMA聚類分析結果（圖2）顯示，在閾值為0.91時，26個棕櫚種源可分成四大類，第Ⅰ類只有都勻（DY）1個種源;第Ⅱ類10個種源，包括貴定（GD）、三都（SD）、湄潭（MT）、鳳岡（FG）、務川（WC）、道真（DZ1）、納雍（NY）、獨山（DS）、丹寨（DZ2）和麻江（MJ）;第Ⅲ類6個種源，包括水城（SC）、普定（PD）、織金（ZJ）、六枝（LZ）、羅甸（LD）和望謨（WM）;第Ⅳ類9個種源，包括貴陽（GY）、甕安（WA）、劍河（JH）、思南（SN）、福泉（FQ）、余慶（YQ）、正安（ZA）、石阡（SQ）和印江（YJ）。可見，屬于同一農業氣候區的棕櫚種源大多數能聚在同一類，即貴州省棕櫚資源的遺傳分化與其地理環境有一定相關性。Mantel檢驗結果（圖2）顯示，貴州省棕櫚資源遺傳分化與其地理距離呈正相關（r=0.2651），但相關性不顯著，說明地理隔離對棕櫚遺傳分化有一定影響，但并非主要因素。

2. 4 棕櫚居群的遺傳分化情況

由表7可知，貴州省棕櫚資源種級水平的Ht為0.2702，Hs為0.1809，Gst為0.3305，說明貴州省棕櫚資源遺傳變異的66.95%來自種源內，而33.05%來自種源間，即種源內變異是貴州省棕櫚資源遺傳變異的主要來源。黔東南區棕櫚種源間的遺傳變異最大，占該區總遺傳變異的30.19%;黔南區棕櫚種源間的遺傳變異最小，為7.40%。貴州省棕櫚資源種級水平的Nm為1.0129，大于1.0000，說明貴州省各棕櫚種源間存在較低的基因流。此外，7個農業氣候區內的棕櫚資源基因流均大于貴州省內棕櫚種源基因流，說明小區域內的棕櫚資源基因交流頻繁。

3 討論

PPB、H和I 是衡量種群遺傳多樣性的3個重要參數。其中，PPB只是一種粗略估計，尚無法確定各條帶在頻率上的均勻程度，且受樣本大小、條帶多少及篩選方法的影響（紅雨等，2006）;而H 和I 充分考慮了群體中的基因數目及其分布均勻度，三者結合可有效反映遺傳多樣性水平（黃勇，2013）。本研究結果表明，貴州省棕櫚物種水平上的PPB為97.31%、H為0.2689、I為0.4212，明顯高于蒙古櫟（李文英，2003）、厚樸（鄭志雷，2010）、杏（馬麗娟，2013）、紫椴（王東升，2013）及玉鈴花（王萱，2016）等常見溫帶多年生木本植物，也明顯高于銀杏（葛永奇等，2003）、構樹（廖聲熙等，2013）及杜仲（于靖，2015）等雌雄異株的木本植物，但在棕櫚科植物中略低于喬木形的董棕（趙春磊，2009）、檳榔（任軍方，2010）及叢生灌木形的山棕（賈春媛，2009），高于黃藤和單葉省藤等木質藤本（楊華，2005）。說明從地理分布、交配系統及生活型等多方面觀察均證實貴州省棕櫚具有豐富的遺傳多樣性。遺傳多樣性與種源地生態條件的相關性分析結果表明，海拔對貴州省棕櫚資源遺傳多樣性分布有顯著影響，可能是由于貴州高海拔山區地勢復雜，交通不便，人為破壞少，能保存較高的遺傳多樣性。棕櫚作為棕櫚科植物中最抗寒的一個種，廣泛的地理分布說明其擁有較大的基因庫及生境異質性，多世代重疊有效保留了重組和突變;而嚴格的雌雄異株異交、風媒花保證了高頻的遠系雜交能力和異交率（朱華晨，2000）。這些特征都可能是棕櫚仍維持較高遺傳多樣的重要原因。

本研究還發現，貴州省棕櫚物種水平上的Gst為0.3305，明顯高于木本植物（Gst=0.2100）及傳粉植物（Gst=0.2300）的平均值（Nybom，2004），說明貴州省棕櫚各種源間已有一定程度的分化。Mantel檢驗結果顯示，貴州省棕櫚資源的遺傳分化與地理隔離呈較弱正相關，僅有不到0.1%的遺傳變異可由地理距離解釋，說明地理隔離不是棕櫚遺傳分化的主要因素。UPGMA聚類分析結果顯示，貴州省棕櫚資源的遺傳分化與地理環境有一定相關性，同一農業氣候區的棕櫚種源大多數聚在同一類，可能是在自然選擇壓力下，具有相同基因型的個體共同聚集在較適應的生境中，從而產生遺傳分化（王玉山等，2011;黃勇，2013;馬少薇等，2017）。這種由生境異質性下選擇壓力及遺傳漂移所形成的遺傳分化大于地理距離所帶來的遺傳分化，但地理環境影響種源分化的具體進程有待進一步探究。此外，貴州省棕櫚資源種級水平的Nm為1.0129，大于1.0000，即貴州省各棕櫚種源間基因流動很少，故推測低水平的基因流動是造成遺傳變異以種源內變異為主、種源間遺傳分化明顯的主要原因。各農業氣候區內棕櫚資源的Nm大于各棕櫚種源間的Nm，表明棕櫚的基因流動受限于小區域范圍內。花粉與種子傳播是棕櫚主要的基因流動形式，二者均受自身特點與環境條件的影響。棕櫚樹體高大，花序抽生于樹頂端、花量巨多、開花集中，使得花粉能借助風力廣泛傳播，但花期時貴州境內多陰雨天氣，不利于花粉大范圍傳播;棕櫚種子較大，果熟期天氣寒冷，鳥獸活動相對較少，故其種子傳播距離有限。這些因素是導致貴州省棕櫚基因流動較低且較窄的主要原因。

棕櫚作為貴州省內重要的生態與經濟樹種，其豐富的遺傳多樣性與種源變異是遺傳改良的寶貴材料，擁有極高的種質資源保育價值。因此，在今后的種質收集與保存工作中，應將黔中區、黔北區和黔西區等棕櫚資源遺傳多樣性相對較豐富的地區劃為核心種源區，設立多個保護點，并盡可能收集多個種群的種子或幼苗，其他地區則應多選擇一些優良單株的家系苗。在此基礎上，結合高通量測序技術與生物信息學分析手段，揭示棕片產量等重要農業性狀的形成機理，或挖掘與之緊密連鎖的分子標記，并綜合篩選出一批特異育種材料，為貴州棕櫚資源的開發利用打下基礎。

4 結論

貴州省棕櫚種質資源總體遺傳多樣性高，種源間分化較明顯，選擇育種潛力巨大。為更好地開發利用棕櫚資源，應結合其遺傳結構特點，實行就地保護為主及建設種質資源庫為補充的保護策略。

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（責任編輯 蘭宗寶）