芐基四氮唑衍生物的合成及抗菌活性研究

鄭賢靜，金成華*，梁承武

(1.延邊大學藥學院，吉林 延吉 133002;2.吉林醫藥學院藥學院，吉林 吉林 132013)

四氮唑類化合物是含有四個氮原子的五元芳香雜環化合物，是一類在藥物有機合成中非常重要的中間體，目前四氮唑化合物應用最為廣泛的包括1位取代、5位取代和1,5位取代四氮唑衍生物[1]。四氮唑化合物結構修飾主要在1，5號位上進行，并且在抗菌領域以及抗高血壓領域主要發揮作用的也是1，5號位修飾的四氮唑化合物，作為中間體進行研究[2]。

近年來在抗菌藥物領域,四氮唑化合物結構作為側鏈結構修飾被引入頭孢類抗生素的應用中,特別是第三代、第四代頭孢類抗生素頭孢類藥物，如氟氧頭孢、頭孢咪唑、頭孢呱酮頭孢替安等，都表現出良好的抗菌活性[3]。

溴化鋅可以催化以芐基疊氮和苯甲酰氰為原料的[2+3]環加成，這是一種合成四氮唑的實用方法,操作簡便、產率高[4]。本研究合成出7個芐基四氮唑類衍生物，并用生長速率法測定化合物的殺菌活性。

1 材料與方法

1.1 路線設計

本實驗主要針對四氮唑化合物1，5號位修飾進行合成研究，如scheme 1，以苯甲酰氯和芐基氯為原料，通過親核取代反應合成出苯甲酰氰化合物(2)和芐基疊氮化合物(4)[5]，最終以溴化鋅為催化劑合成化合物5。在scheme 2所示，以不同的合成路線，以苯甲酰氯為原料，先與疊氮化鈉進行[2+3]環合為四氮唑類化合物[6]，然后與芐基氯進行親核取代，最終合成化合物5等衍生物。

Scheme 1(a):三甲基氰硅烷,碘化鋅,100 ℃,2 h;(b)疊氮化鈉，N,N-二甲基甲酰胺,甲苯,75 ℃,3.5 h;(c):溴化鋅2,N,N-二甲基甲酰胺,回流20 h。

R=a:-H,b:4-CH3,c:4-OCH3,d:4-Cl,e:4-F,f:4-Br,g:4-OH

Scheme 2(a):三甲基氰硅烷,碘化鋅,100 ℃,2 h;(c):溴化鋅2,N,N-二甲基甲酰胺,回流,20 h;(d)疊氮化鈉，N,N-二甲基甲酰胺,甲苯,75 ℃,5 h。

R=a:-H,b:4-CH3,c:4-OCH3,d:4-Cl,e:4-F,f:4-Br,g:4-OH

1.2 儀器與試劑

JH21O2電子天平；IBUCHI旋轉蒸發儀；DZF-6050型真空干燥箱；KQ-C玻璃儀器氣體烘干箱；DLSB-5/25 ℃(KEER)冷凝器；BHX-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱；SHZ-Ⅲ循環水真空泵(南京科爾儀器設備有限公司)；Bruker Avance-500型核磁共振譜儀(均以CDCl3為溶劑,TMS為基準物質)。

苯甲酰氯(98%，天津市凱信化學工業有限公司)；芐基氯(98%，國藥集團化學試劑有限公司)；疊氮化鈉；二甲基甲酰胺(99%)；三甲基氰硅烷(98%，麥克林)；碘化鋅；溴化鋅(天津市光復精細化工研究所)，其余試劑均為分析純級別。

測試中所用到的革蘭陽性菌包括：金黃色葡萄球菌(S.Aureus4220)、耐喹諾酮金黃色葡萄球菌、耐加氧西林金黃色葡萄球菌、白色念珠菌(Candidaalbicans7535)、變形鏈球菌(Streptococcusmutans3289)。革蘭陰性菌：大腸桿菌(E.coli1924)。其中對照藥選取加替沙星(Gatifloxacin)和莫西沙星(Moxifloxacin)作為參考。

1.3 合 成

1.3.1苯甲酰氰(2)的合成

安裝回流反應裝置，加入1.05 g(10.46 mmol)三甲基氰硅烷，將苯甲酰氯1.5 g(10.46 mmol)緩慢滴加入三甲基氰硅烷中，加入催化劑量的碘化鋅16.73 mg(50 μmol)，攪拌條件下加熱到100 ℃，反應2 h，薄層色譜監測反應完全。加入10.46 mL冰水，用乙酸乙酯10 mL萃取3次，合并油相，并用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓除去乙酸乙酯，得無色的油狀物質化合物(2)，收率為70%。

1.3.2芐基疊氮(4)的合成

先安裝200 mL的兩口瓶，置于冰浴條件下，加入5.00 g(37.5 mmol)的芐基氯，加入4.93 g(3.753 mmol)的疊氮化鈉，加入溶劑16.11 mL的DMF和16.11 mL的甲苯，攪拌條件下加熱到70 ℃。保溫3.5 h，反應結束，用薄層色譜檢測。加入150 mL去離子水，用甲苯(16.11 mL)萃取3次，合并油相甲苯，并用無水硫酸鈉干燥1 h，過濾，減壓除去甲苯。得化合物(4)，收率為68%。

1.3.3苯基(1H-四唑-5-基)甲酮(6)的合成

安裝100 mL的兩口瓶，將疊氮鈉0.742 g(11.42 mmol)加入到苯甲酰氰1.00 g(9.52 mmol)中，加入溶劑(DMF 5 mL)，加入催化量的溴化鋅，攪拌下加熱回流20 h，并用薄層色譜監測。降溫到常溫，放入冰水中出現黃色的固體，加入0.73 mL HCl固體溶解，繼續攪拌2 h，又重新析出固體，然后過濾并用水洗。得終產物(6)，收率為62%。

1.3.4(1-芐基-1H-四唑-5-基)(苯基)甲酮(5)的合成通法

安裝100 mL的兩口瓶，將疊氮化芐基1.55 g(11.42 mmol)加入到苯甲酰氰1.00 g(9.52 mmol)中，加入溶劑(DMF 5 mL)，加入催化量的溴化鋅，攪拌下加熱回流20 h，并用薄層色譜監測。降溫到常溫，再放入冰水中會出現黃色的固體，加入0.95 mL HCl固體溶解，繼續攪拌2 h，又重新析出固體，然后過濾并用水洗，得終產物(5)。

1.4 體外抗菌活性篩選

最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)是細菌在體外培養基上接種，在18～24 h內能夠抑制其生長所需的最低藥物濃度。這是一項常用的衡量化合物抗菌活性的重要指標。本實驗對合成的化合物進行MIC活性的測試，并且對比它們結構與活性的關系。

具體細篩操作過程：將5 mg的待測樣品溶于782 μL的DMSO中。在2 mL的MHB(Mueller-Hinton broth)培養基中將20 μL待測菌種接種培養至對數期，之后在培養皿中用培養基將細菌稀釋為105CFU/mL。首先取100 μL的培養基于待測的96孔板中，根據二倍稀釋法原理，獲得一系列的樣品濃度為64～1 mg/L。之后向每個微孔內加入100 μL的待測菌稀釋液，然后將96孔板放入650 nm的酶標儀中，觀察記錄其吸光度。37 ℃的培養箱內培養20～24 h后，再將96孔板放入酶標儀中，記錄此時的吸光度。同一塊96孔板，根據前后吸光度的變化，運用相應的公式，計算出每種藥品的MIC值。實驗平行進行3次。

2 結 果

2.1 合成實驗結果

通過合成，共得到了7個的芐基四氮唑結構的化合物，化合物的結構經1H NMR和質譜確證。

(1-benzyl-1H-tetrazol-5-yl)(phenyl)methanone(5a)：yellow solid，yield 72%；m.p.80～83 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ 8.40(d,2H),7.83-7.80(m,1H),7.55(m,2H),7.37-7.33(m,5H),3.46(s,2H)。m/z 265.28(M+)。

[1-(4-methylbenzyl)-1H-tetrazol-5-yl](phenyl)methanone(5b):yellow solid，yield 78%；m.p.91～93 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ 8.39(d,2H),7.88-7.85(m,1H),7.58(m,2H),7.11(d,2H),7.01(d,2H),5.46(s,2H),2.19(S,3H)。m/z 279.41(M+)。

[1-(4-methoxybenzyl)-1H-tetrazol-5-yl](phenyl)methanone(5c):yellow solid，yield 66%；m.p.101～103 ℃；1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ 8.40(d,2H),7.85-7.82(m,1H),7.57(m,2H),7.10(d,2H),7.00(d,2H),5.44(s,2H),3.91(S,3H)。m/z 295.47(M+)。

[1-(4-chlorobenzyl)-1H-tetrazol-5-yl](phenyl)methanone(5d):yellow solid，yield 65%，m.p.105～107 ℃，1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ 8.33(d,2H),7.73-7.71(m,1H),7.58(m,2H),7.12(d,2H),7.02(d,2H),5.48(s,2H)。m/z 299.70(M+)。

[1-(4-bromobenzyl)-1H-tetrazol-5-yl](phenyl)methanone(5e):yellow solid，yield 79%，m.p.118～121 ℃，1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ 8.29(d,2H),7.77-7.70(m,3H),7.58-7.56(m,2H),7.03-7.05(d,2H),5.47(s,2H)。m/z 344.38(M+)。

[1-(4-fluorobenzyl)-1H-tetrazol-5-yl](phenyl)methanone(5f):yellow solid，yield 80%，m.p.104～106 ℃，1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ 8.35(d,2H),7.72-7.70(m,1H),7.58-7.56(m,2H),7.14-7.11(m,4H),5.46(s,2H)。m/z 283.34(M+)。

[1-(4-hydroxybenzyl)-1H-tetrazol-5-yl](phenyl)methanone(5g):yellow solid，yield 56%，m.p.78～80 ℃，1H NMR(300 MHz,DMSO-d6)δ 9.08(s,1H),8.31(d,2H),7.73-7.71(m,1H),7.58-7.56(m,2H),6.95-6.92(d,2H),6.63-6.61(d,2H),5.49(s,2H)。m/z 281.30(M+)

2.2 抗菌實驗結果

本研究根據新藥設計拼合原理，共計合成了7個芐基四氮唑結構的化合物。實驗選用了3個不同取代基的化合物進行抑菌活性研究，探究推電子效應與吸電子效應對芐基四氮唑類衍生物抗菌活性的影響。結果如表1所示，化合物5 d對所測細菌都表現出較好的抗菌活性，其對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌4220和對革蘭氏陰性菌大腸桿菌1924的最低抑菌濃度均達到8 mg/L,弱于陽性對照藥加替沙星和莫西沙星。另外，化合物5 d對真菌白色鏈球菌7535的抑菌濃度達到16 mg/L。

表 1 化合物對不同細菌的MIC(mg/L)

1.StaphylococcusaureusRN4220;2.Streptococcus mutans 3289;3.EscherichiacoliKCTC1924;4.Pseudomonasaeruginosa2742;5.SalmonellaentericaserovarTyphimurium2421;6.Candidaalbicans7535;7.Quinolone-resistantS.aureusCCARM3505;8.Methicillin-resistantS.aureusCCARM3506

3 討 論

四氮唑化合物的特性在作為官能團時與羧酸相似,解離常數pKa值比較相近,空間結構的平面離域體系也比較相近,可以很好地替代羧酸一類生物藥物在生物代謝過程中的作用。正因為四氮唑類化合物具有這些特殊的功能和結構，所以關于四氮唑的研究越來越多[7]。20世紀50年代對于四氮唑化合物的合成及研究發展迅速，合成出的四氮唑類化合物大約300多種，使得其在藥物、農業、化學和供能材料等方面得到廣泛應用[8]。

構效關系研究發現：苯環上Cl取代時，化合物表現出抗菌活性；苯環上取代基活性關系：4-Cl>4-F>4-CH3；苯環上的吸電子基團活性大于供電子基團。