一株分離于含水層介質(zhì)的好氧反硝化菌脫氮性能研究*

朱曉明 趙東華 阮曉紅

(1.中交上海航道勘察設(shè)計(jì)研究院有限公司，上海 200120；2.南京大學(xué)地球科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210093)

近年來(lái)，由于經(jīng)濟(jì)社會(huì)快速發(fā)展，工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)所產(chǎn)生的污廢水排放量顯著增加，全球范圍內(nèi)出現(xiàn)了不同程度的水體氮污染問題，如何有效脫氮成為水污染防治領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題[1],[2]523,[3]。生物脫氮相比物理或化學(xué)脫氮方法是比較高效、經(jīng)濟(jì)的污水脫氮方法[4]4242,[5]。傳統(tǒng)生物脫氮理論認(rèn)為，反硝化只能在無(wú)氧或厭氧條件下進(jìn)行[2]523，但近年好氧反硝化菌被不斷報(bào)道，在河道[6]、湖泊[2]523,[7]、水庫(kù)[8]5508、海洋[9-10]、土壤[11]、水田[12]998、濕地[13]1314等自然環(huán)境和活性污泥或生物膜反應(yīng)器[14-16]、焦化廢水[17]、石化污水[18]、垃圾滲濾液[19-20]、養(yǎng)殖廢水[21]等人工環(huán)境中均有發(fā)現(xiàn)，包括假單胞菌屬(Pseudomonas)、副球菌屬(Paracoccus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、根瘤菌屬(Rhizobium)、無(wú)色桿菌屬(Achrobacter)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)等，但淺層地下水含水層介質(zhì)中的好氧反硝化菌分離和脫氮性能研究還鮮有報(bào)道。

淺層地下水極易受含氮污染物污染。已有研究發(fā)現(xiàn)，太湖流域多地淺層地下水存在不同程度的“三氮”污染問題[22-24]。好氧反硝化菌生長(zhǎng)快速、適應(yīng)性強(qiáng)、脫氮效率高[12]997，含水層介質(zhì)中好氧反硝化菌的發(fā)現(xiàn)可為淺層地下水氮污染修復(fù)提供一種可能途徑。

本研究在蘇州某一受氮污染的淺層地下水含水層介質(zhì)中分離、純化得到一株好氧反硝化菌，從形態(tài)、生理生化和分子生物學(xué)等方面鑒定了該菌株，并研究了其好氧反硝化脫氮性能、生長(zhǎng)過(guò)程及脫氮?jiǎng)恿W(xué)，考察了脫氮性能的影響因素，為好氧反硝化菌在淺層地下水氮污染修復(fù)工程中的實(shí)際工程應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株分離樣品采自蘇州某一受氮污染的淺層地下水含水層介質(zhì)，位于地表以下6.5 m處，土壤為粉質(zhì)黏土，現(xiàn)場(chǎng)采集樣品后用無(wú)菌采樣管密封保存，4 ℃條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

富集培養(yǎng)基：KNO3，2.0 g；檸檬酸三鈉，5.0 g；MgSO4·7H2O，0.2 g；KH2PO4，1.0 g；去離子水，1 L；微量元素溶液，2 mL；pH調(diào)為7.0～7.5。其中，微量元素溶液：乙二胺四乙酸二鈉，57.1 g/L；ZnSO4，2.2 g/L；CaCl2，5.3 g/L；MnCl2，3.2 g/L；FeSO4，2.7 g/L；(NH4)6Mo7O24，1.0 g/L；CuSO4，1.0 g/L；CoCl2，0.9 g/L；pH 為7.0。

反硝化液體培養(yǎng)基：KNO3，0.72 g/L；其余同富集培養(yǎng)基。反硝化固體培養(yǎng)基另需加入2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂。

1.2 主要儀器

SG6型便攜式DO儀、PHPJ-260型便攜式pH計(jì)、IL550型總有機(jī)碳(TOC)分析儀、UV2100型紫外/可見分光光度計(jì)、ZWF-1112型立式雙層大容量恒溫振蕩器、D-37520型離心機(jī)、ALD1244型電泳儀、QuantStudio 3型實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀。

溫度、DO由DO儀測(cè)定，pH、氧化還原電位(ORP)由pH計(jì)測(cè)定，硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、總氮分別采用紫外分光光度法、N-(1-萘基)乙二胺分光光度法、過(guò)硫酸鉀氧化—紫外分光光度法測(cè)定，溶解性有機(jī)碳(DOC)經(jīng)離心過(guò)濾后由TOC分析儀測(cè)定，波長(zhǎng)600 nm處吸光度(OD600)用紫外/可見分光光度計(jì)測(cè)定。

2 實(shí)驗(yàn)研究方法

2.1 菌株的分離和鑒定

2.1.1 菌株分離、純化和篩選

取10 g新鮮菌株分離樣品接種于90 mL滅菌富集培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)3 d，然后取菌液5 mL接種于新的富集培養(yǎng)基上再培養(yǎng)3 d，重復(fù)富集3次。取1 mL富集后菌液涂于反硝化固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)3 d后將不同形態(tài)的菌落進(jìn)行分離，多次分離后，將純化的菌株接種于裝有5 mL反硝化液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃下在180 r/min的恒溫振蕩器上振蕩培養(yǎng)3 d，吸取少量菌液，滴加格里斯試劑、二苯胺試劑和奈氏試劑篩選好氧反硝化菌，記為菌株P(guān)J21。

2.1.2 菌株形態(tài)和生理生化鑒定

將菌株P(guān)J21在反硝化固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，長(zhǎng)出單菌落后進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化特性測(cè)試[25]。

2.1.3 分子生物學(xué)鑒定

利用DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit DP302)提取菌株P(guān)J21的16S rDNA并進(jìn)行擴(kuò)增。采用細(xì)菌通用正向引物(27F)和反向引物(1492R)進(jìn)行擴(kuò)增[8]5508，構(gòu)建50 μL反應(yīng)體系：模板DNA 1 μL，脫氧核糖核苷三磷酸(0.2 mmol/L)4 μL，引物(0.5 μmol/L)各2 μL，10×Buffer 5 μL，MgCl2(2 mmol/L) 3 μL，Taq酶(2.5 U/μL)0.25 μL，超純水32.75 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入熱循環(huán)(94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán))。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用The QuickClean Ⅱ膠回收試劑盒純化，然后將PCR產(chǎn)物連接到TA載體進(jìn)行克隆，委托深圳華大基因科技有限公司測(cè)序，輸入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行Blast細(xì)菌基因序列同源性比對(duì)，用MEGA軟件中Kimura-Parameter Distance模型計(jì)算進(jìn)化距離，采用 Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.2 脫氮性能及其影響因素研究

2.2.1 脫氮性能初探

將菌株P(guān)J21接種于反硝化液體培養(yǎng)基，28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)1 d制得種子液，將種子液以1%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入新的反硝化液體培養(yǎng)基，在好氧(DO=6.9～7.8 mg/L)，初始硝酸鹽氮(用KNO3配制，下同)也即總氮質(zhì)量濃度276.95 mg/L，DOC(用檸檬酸三鈉配制，作碳源)質(zhì)量濃度1 400 mg/L，28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)60 h，每隔一定時(shí)間取樣檢測(cè)總氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、DOC及OD600。

脫氮率或DOC利用率(η，%)和脫氮速率(R，mg/(L·h))分別按式(1)和式(2)計(jì)算[26]。

η=(C1-C2) /C1×100%

(1)

R=(C1-C2) / (t2-t1)

(2)

式中：C1、C2分別為t1、t2時(shí)刻的氮或DOC質(zhì)量濃度，mg/L。

2.2.2 影響因素研究

在2.2.1節(jié)的基本條件下探索了碳源類型、溫度、初始pH 3個(gè)因素對(duì)菌株P(guān)J21好氧反硝化性能的影響。碳源類型考察了琥珀酸鈉、檸檬酸三鈉、蘋果酸鈉、葡萄糖和蔗糖(初始硝酸鹽氮50.00 mg/L，DOC與總氮質(zhì)量比(C/N)為10，pH=7.5)；溫度考察了10、20、25、30、35、40 ℃(初始硝酸鹽氮50.00 mg/L，C/N=10，pH=7.5)；初始pH考察了4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0(初始硝酸鹽氮50.00 mg/L，C/N=10)。影響因素研究時(shí)培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600、DOC、硝酸鹽氮變化。

2.3 菌株生長(zhǎng)及脫氮?jiǎng)恿W(xué)研究

2.3.1 生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

根據(jù)Monod方程研究微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)[27]437,[28]16，計(jì)算菌株P(guān)J21的最大比生長(zhǎng)速率和Monod生長(zhǎng)半飽和系數(shù)。

2.3.2 衰亡動(dòng)力學(xué)

衰亡過(guò)程采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程(見式(3))來(lái)計(jì)算。

r1=K1X

(3)

式中：r1為微生物衰亡速率，mg/(L·s)；K1為衰亡速率系數(shù)，s-1；X為微生物質(zhì)量濃度，mg/L，數(shù)值上通過(guò)480倍OD600估算得到。

2.3.3 硝酸鹽氮降解動(dòng)力學(xué)

在Monod方程中引入產(chǎn)率系數(shù)可得到硝酸鹽氮降解速率方程并解得相關(guān)參數(shù)[27]438,[28]18。

3 結(jié)果與討論

3.1 菌株鑒定結(jié)果

菌株P(guān)J21的菌落形態(tài)如圖1所示，菌落呈直徑1～3 mm的圓形，表面光滑，球形隆起，波狀邊緣，顏色為淡黃色，半透明。

菌株P(guān)J21的生理生化特性如表1所示。采用半固體穿刺法對(duì)該菌株進(jìn)行需氧性和運(yùn)動(dòng)性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，菌株能夠沿著穿刺線穿透培養(yǎng)基擴(kuò)散生長(zhǎng)，說(shuō)明菌株能夠在好氧和缺厭氧條件下兼性生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)。

圖1 菌株P(guān)J21的菌落形態(tài)Fig.1 Morphological characteristics of bacterial colony of strain PJ21

表1 菌株P(guān)J21的生理生化特性

分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，菌株P(guān)J21與多株假單胞菌屬的門多薩菌(Pseudomonasmendocina)同源性達(dá)99%，可確定菌株P(guān)J21為假單胞菌屬的門多薩菌。

3.2 菌株好氧反硝化脫氮性能

由圖2可知，硝酸鹽氮在0～18 h迅速下降，尤其在0～6 h時(shí)，硝酸鹽氮從276.95 mg/L降至109.05 mg/L，12～24 h時(shí)降速減緩，24～60 h時(shí)下降很慢，幾乎不再下降，60 h時(shí)硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為12.32 mg/L。總氮在0～18 h內(nèi)變化規(guī)律和硝酸鹽氮相似，18 h后基本趨于穩(wěn)定。從氮的質(zhì)量平衡分析，說(shuō)明在通過(guò)好氧反硝化過(guò)程脫除氮的同時(shí)，也有部分硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化為了菌體生長(zhǎng)的內(nèi)源氮。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度很低，為0.23～0.34mg/L，沒有出現(xiàn)明顯的亞硝酸鹽氮累積現(xiàn)象。

圖2 氮質(zhì)量濃度變化Fig.2 Variation of nitrogen mass concentrations

由圖3可知，0～6、0～12、0～18、0～24 h的硝酸鹽氮脫氮率分別為60.62%、75.86%、87.11%、91.18%，DOC利用率分別為40.29%、55.68%、78.34%、88.67%；由圖4可知，0～6、6～12、12～18、18～24 h的硝酸鹽氮脫氮速率分別為27.98、7.03、5.19、1.88 mg/(L·h)。24 h后脫氮率、DOC利用率和脫氮速率都趨于穩(wěn)定。培養(yǎng)結(jié)束(60 h)時(shí)，硝酸鹽氮脫氮率為95.55%，總氮脫氮率為65.42%；整個(gè)過(guò)程硝酸鹽氮的平均脫氮速率為4.41 mg/(L·h)，高于王秀杰等[4]4249報(bào)道的4.08 mg/(L·h)，黃廷林等[8]5509報(bào)道的0.06～0.07 mg/(L·h)，冶青等[12]1001報(bào)道的1.05 mg/(L·h)。

圖3 脫氮率和DOC利用率Fig.3 Efficiencies of nitrogen removal and DOC utilization

圖4 硝酸鹽氮脫氮速率Fig.4 Denitrification rates of nitrate nitrogen

3.3 脫氮性能影響因素探究

3.3.1 碳源類型的影響

如圖5所示，菌株P(guān)J21在以檸檬酸三鈉、琥珀酸鈉、蘋果酸鈉、葡萄糖和蔗糖為碳源時(shí)均能生長(zhǎng)，但存在明顯差異。以檸檬酸三鈉為碳源時(shí)，菌株P(guān)J21的硝酸鹽氮脫氮率、DOC利用率最高，分別為81.24%、60.31%；其次是以葡萄糖為碳源時(shí)，硝酸鹽氮脫氮率、DOC利用率分別為20.86%、32.09%；琥珀酸鈉、蔗糖和蘋果酸鈉為碳源時(shí)，硝酸鹽氮脫氮率、DOC利用率較低。可見，菌株P(guān)J21的最佳碳源為檸檬酸三鈉。

圖5 碳源類型對(duì)菌株P(guān)J21的影響Fig.5 Effect of carbon sources on strain PJ21

3.3.2 溫度的影響

溫度通過(guò)影響微生物體內(nèi)酶活性從而影響脫氮效率[12]999。由圖6可見，不同溫度下菌株P(guān)J21的生長(zhǎng)和硝酸鹽氮脫氮率具有明顯差異，10～30 ℃時(shí)隨著溫度上升脫氮率和OD600升高；而30～40 ℃時(shí)隨著溫度上升脫氮率和OD600下降。菌株P(guān)J21生長(zhǎng)的適宜溫度為25～35 ℃，最適溫度為30 ℃。

圖6 溫度對(duì)菌株P(guān)J21的影響Fig.6 Effect of temperature on strain PJ21

3.3.3 初始pH的影響

由圖7可知，不同初始pH條件下菌株P(guān)J21的生長(zhǎng)和硝酸鹽氮脫氮率存在顯著差異。當(dāng)初始pH為4.0～7.0時(shí)，隨著初始pH增大脫氮率和OD600增加；而當(dāng)初始pH為7.0～9.0時(shí)，隨著初始pH增大脫氮率和OD600下降。菌株P(guān)J21生長(zhǎng)較適宜的初始pH為6.0～8.0，最適初始pH為7.0，與陳玲等[13]1319報(bào)道的假單胞菌屬適宜初始pH相近。

3.4 菌株P(guān)J21的生長(zhǎng)及其脫氮?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)計(jì)算結(jié)果

由圖8(a)的OD600和DOC變化曲線可知，菌株

圖7 初始pH對(duì)菌株P(guān)J21的影響Fig.7 Effect of initial pH on strain PJ21

圖8 菌株P(guān)J21生長(zhǎng)過(guò)程分析Fig.8 Process of growth analysis of strain PJ21

PJ21的生長(zhǎng)遲緩期很短，很快速進(jìn)入了對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，生長(zhǎng)穩(wěn)定期也較短，而衰亡期較長(zhǎng)。由圖8(b)可知，反硝化液體培養(yǎng)基的pH和ORP在遲緩期和衰亡期內(nèi)變化很小，而在對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期和生長(zhǎng)穩(wěn)定期內(nèi)發(fā)生顯著變化。

菌株P(guān)J21的最大比生長(zhǎng)速率和Monod生長(zhǎng)半飽和系數(shù)分別為4.30×10-4s-1、142.99 mg/L。衰亡速率系數(shù)為7.90×10-5s-1(R2=0.991，說(shuō)明適合采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合)。硝酸鹽氮降解過(guò)程的產(chǎn)率系數(shù)為1.26。

4 結(jié) 論

(1) 從受氮污染的淺層地下水含水層介質(zhì)中分離、純化得到一株好氧反硝化細(xì)菌PJ21，經(jīng)形態(tài)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定確定其為假單胞菌屬門多薩菌。

(2) 菌株P(guān)J21具有高效好氧反硝化能力，能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速反硝化脫氮，培養(yǎng)60 h后總氮、硝酸鹽氮脫氮率分別可達(dá)65.42%、95.55%，最大硝酸鹽氮脫氮速率可達(dá)27.98 mg/(L·h)，平均脫氮速率為4.41 mg/(L·h)，且不會(huì)有明顯的亞硝酸鹽氮累積現(xiàn)象。

(3) 菌株P(guān)J21的最佳碳源為檸檬酸三鈉；適宜生長(zhǎng)溫度為25～35 ℃，最適溫度為30 ℃；適宜生長(zhǎng)的初始pH為6.0～8.0，最佳為7.0。

(4) 菌株P(guān)J21生長(zhǎng)遲緩期和穩(wěn)定期均較短，能夠快速進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，但衰亡期較長(zhǎng)；最大比生長(zhǎng)速率和Monod生長(zhǎng)半飽和系數(shù)分別為4.30×10-4s-1、142.99 mg/L，衰亡速率系數(shù)為7.90×10-5s-1，硝酸鹽氮降解過(guò)程的產(chǎn)率系數(shù)為1.26。