ENU誘變草魚家系生長特性及肌肉生長抑制素基因SNP篩選的研究

王成龍，陳 杰，蔣霞云，鄒曙明

( 上海海洋大學，農業農村部淡水水產種質資源重點試驗室，上海 201306 )

N-乙基-N-亞硝基脲(ENU)是一種常用的化學誘變劑，它能對基因組DNA堿基產生烷基化修飾，使DNA在復制時發生錯配，導致突變體生成[1-2]。ENU主要誘發不定點的單堿基突變，無任何傾向性，從而使基因發生突變，其誘變模式與自然變異相似[3-4]。同時，ENU誘變效率很高，約為其他誘變手段的10倍。在模式生物中，利用ENU獲得大規模突變體進行功能基因的研究已成為常用手段。但在養殖魚類中的應用報道很少。目前，僅前蘇聯采用ENU誘變結合雌核發育技術獲得了鯉魚優良突變品系[5]。國內方面，韓啟霞等[6]采用ENU浸泡的方法誘變銀鯽(Carassiusauratusgibelio)得到突變個體，鄒曙明等[7]用ENU誘變處理草魚(Ctenopharyngodonidellus)精子，產生了生長速度顯著不同的F1代。

草魚肌肉生長抑制素(MSTN)基因是一種肌細胞生長負向調控因子，具有抑制肌肉分化和生長的作用，其表達量與肌肉質量的變化呈負相關[8-10]。目前，針對MSTN基因在哺乳動物方面的功能及調控機理研究較多[11-15]，在水產動物方面其研究還處于cDNA克隆與表達階段，功能研究相對較少[16-19]。魚類MSTN基因存在兩種亞型(MSTN1、MSTN2)并且時空表達具有較大的差異。濮劍威等[20]研究表明，MSTN1基因在草魚肌肉、腦和眼中的轉錄量較高，MSTN2基因只在腦和肌肉中有表達。并且通過注射MSTN1型mRNA過表達可導致斑馬魚(Daniorerio)體節發生期胚胎的前后軸拉長、背腹軸變短、脊索輕微扭曲及體節發育受到強烈抑制而不分化等現象。注射MSTN2型 mRNA胚胎早期發育有所延遲并未發生明顯變化，但發育至60 h之后尾部明顯發生嚴重彎曲。

單核苷酸多態性(SNP)是指在基因組水平上由于單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。SNP作為第三代分子遺傳標記在分子育種方面已經得到廣泛的應用[21-22]。MSTN基因的SNPs與生長性狀的關聯研究在畜禽方面已有大量的報道[23-25]，在水產動物方面，MSTN1基因在黃顙魚(Pelteobagrusefulvidraco)[26]、建鯉(Cyprinuscarpiovar.jian)[27]、吉富羅非魚(OreochromisniloticusGIFT)[28]、草魚[29]等可作為育種的候選分子標記，而MSTN2基因SNPs與生長性狀的關聯研究未見報道。筆者通過研究ENU誘變草魚4個家系的生長，對比篩選出2個具有顯著生長差異的家系，通過雙向測序在這2個家系中MSTN1、MSTN2基因找出SNP位點，為ENU誘變草魚生長性狀的分子標記輔助育種提供候選標記。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及管理

ENU誘變草魚親本來自于上海海洋大學農業農村部團頭魴(Megalobramaamblycephala)育種中心。挑取6齡優良ENU誘變草魚親本進行人工繁殖，雌、雄草魚各4尾，每尾約25 kg。對親本進行一雌一雄交配方式干法授精，建立4個ENU誘變草魚家系，將每個家系的受精卵分別放至孵化桶里進行孵化，待受精卵孵化成平游的魚苗后，取每個家系魚苗約2000尾放入6 m×4 m×1.5 m的水泥池中暫養1個月后，再將每個家系魚苗平均分到2個水泥池中暫養65 d，從魚苗平游開始計算，第80 d通過剪鰭標記法對家系1、家系2、家系3和家系4分別剪左胸鰭、不剪鰭、右胸鰭和左腹鰭加以區分，從每個家系中隨機挑選50尾稱量體質量后同池混養，設置3個平行試驗組，約每隔30 d對每個家系補剪鰭后放回原水泥池，經過175 d飼養，在每個水泥池各個家系中隨機挑選20尾進行生長指標測量，測量完將4個家系草魚放到同一個土塘進行飼養，放塘之前每個家系各取10尾魚鰭浸于95%酒精中，-20 ℃保存備用。

1.2 生長指標測量

用電子稱測量草魚體質量(精確到0.01 g)；用直尺、圓規測量全長、體長、頭長、體高、尾柄長、尾柄高、體厚形態性狀(精確至0.1 cm)。

1.3 基因組DNA提取及SNPs篩選

參照北京天根生物科技有限公司的海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)說明書提取樣品基因組DNA。基因組DNA提取完成后，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測DNA質量和含量，-20 ℃保存備用。

根據美國國立生物技術信息中心GenBank數據庫公布的草魚MSTN1、MSTN2基因序列，采用Primer Premier 5軟件設計MSTN1、MSTN2基因所需引物，基因所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，所用引物序列及長度見表1。PCR反應體系為50 μL：模板DNA 60～100 ng，10×Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 2 μL，Taq酶(2.5 U/μL)1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，0.1% DEPC處理過的去離子水補至50 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～90 s，35個循環；72 ℃后延伸10 min，4 ℃終止反應。取3 μL PCR擴增產物，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，電泳條帶符合送測要求后，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。測序的結果利用BioEdit軟件確定SNP位點(突變率高于30%)。

表1 ENU誘變草魚MSTN1、MSTN2基因部分區域擴增SNP位點篩選所用的引物Tab.1 Primers used for screening SNP loci in partial regions of MSTN1 and MSTN2 genes in ENU mutagenized grass carp

1.4 數據統計與分析

使用SPSS 19.0軟件[21]中一般線性模型對4個ENU誘變草魚家系的全長、體長、體高、頭長、尾柄長、尾柄高、體厚等性狀進行相關性分析。運用美國國立生物技術信息中心、BioEdit對MSTN1、MSTN2基因中SNPs位點及氨基酸翻譯進行比對。

2 結 果

2.1 ENU誘變草魚4個家系生長性狀對比

第80 d，平均體質量為家系1>家系4>家系3>家系2，絕對質量增加率為家系1>家系4>家系3>家系2；第175 d，平均體質量為家系4>家系1>家系2>家系3，絕對體質量增加率為家系4>家系2>家系1=家系3(表2)。

4個ENU誘變草魚家系在第175 d各生長性狀情況見表3，除家系1和家系2的體高和頭長差異不顯著外，其他不同階段每兩個家系間的各個性狀均差異顯著。

表2 4個ENU誘變草魚家系不同階段體質量的增長統計Tab.2 Growth statistics of body weight in four ENU mutagenized grass carp families with different stages

表3 4個ENU誘變草魚家系各生長性狀特征值Tab.3 Characteristics of growth traits of four ENU mutagenized grass carp families

注：同一行數字后的字母不同表示差異顯著(P<0.05).

Note: means with different letters in the same line are significant differences(P<0.05).

對4個ENU誘變草魚家系在第175 d各形態性狀與體質量的相關程度進行了偏相關分析，結果見表4，各形態性狀與質量顯著性相關由P<0.01判斷，因此各家系中與體質量顯著性相關的性狀分別為：家系1中有全長、體長、尾柄長、體厚，相關系數依次為0.357、0.619、0.608、0.396；家系2中有全長、體長、頭長、體厚，相關系數依次為0.348、0.360、0.687、-0.384；家系3中有全長、體長、尾柄長、尾柄高，相關系數依次為0.529、0.449、-0.351、0.384；家系4中有全長、體長、體厚，相關系數依次為0.629、0.543、0.590。

對4個ENU誘變草魚家系在第175 d的全長、體高、頭長、尾柄長、尾柄高、體厚、體質量與體長的比例性狀進行了因子分析。通過KMO和Bartlett檢驗其度量值為0.705接近1，因此適合因子分析，其中第一主成分(P1)和第二主成分(P2)的貢獻率分別為39.11%、18.98%，累計貢獻率為58.09%，表達式分別為：

P1=-0.113x1+0.376x2+0.436x3+0.228x4+0.006x5+0.335x6-0.033x7；

P2=0.368x1-0.014x2-0.372x3+0.065x4+0.400x5+0.053x6+0.408x7。

式中，x1為全長/體長、x2為體高/體長、x3為頭長/體長、x4為尾柄長/體長、x5為尾柄高/體長、x6為體厚/體長、x7為體質量/體長。

各比例性狀的分布見圖1，7個比例性狀可分成兩組，第一主成分主要為體高/體長、頭長/體長、尾柄長/體長、體厚/體長，第二主成分主要為全長/體長、尾柄高/體長、體質量/體長。

每個家系個體根據第一主成分和第一主成分相關系數得分繪制散點圖(圖2)，家系4在第一主成分、第一主成分得分區域分布明顯與其他3個家系不同，家系2和家系3大部分個體分布重疊，家系1與家系2、家系3都有少部分個體質量重疊。

注：P<0.01表示極其顯著.

Note:P<0.01 means very significantly different.

圖1 比例性狀因子主成分得分系數分布Fig.1 The coefficient distribution map of principal component score of proportional trait factor

圖2 4個ENU誘變草魚家系的各比例性狀特征主因子散點示意Fig.2 The scatter plot map of proportional trait factor in four ENU mutagenized grass carp families

2.2 MSTN1、MSTN2基因序列分析及SNPs位點篩選

本試驗獲得草魚MSTN1基因全長共3824 bp，包括2個內含子(長度分別為776、1008 bp)和3個外顯子(長度分別為375、370、382 bp)，其GenBank為KP719016；對于MSTN2的mRNA全長共1976 bp，其GenBank為KM874827.1。對MSTN基因進行雙向測序，堿基在家系內出現2次以上(包括2次)即確定為SNP突變位點。

對于MSTN1基因，家系3、4均在465位點C/G發生錯義突變，導致該位點編碼的氨基酸由脯氨酸變為精氨酸，家系3還在467位點G/A均發生錯義突變，導致該位點編碼的氨基酸由天冬氨酸變為天冬酰胺(圖3)。

對于MSTN2基因，家系3、4均在912位點C/T發生同義突變，編碼的氨基酸為絡氨酸，另外家系3在1027位點G/A產生錯義突變，導致該位點編碼的氨基酸由纈氨酸變為異亮氨酸，而家系4在366位點A/G產生錯義突變，導致該位點編碼的氨基酸由谷氨酰胺變為精氨酸(圖4)。而位于非編碼區1390位點A/T和1401位點G/A發現SNP位點(圖4)。

3 討 論

3.1 生長對比設計

在生長對比試驗中，試驗對象初始規格的差異可以影響到整個試驗結束的結果[30]，為減少前期生長差異對后期試驗的影響，親魚催產、人工授精、受精卵孵化、魚苗放到水泥池暫養的整個過程均同步進行，到了第80 d對每個ENU誘變草魚家系隨機挑取50尾進行剪鰭標記同池混養，設置3個平行試驗組，克服不同水泥池對生長對比造成的影響。在整個飼養管理過程中，每日定時投喂2次，每次以水面留有少量飼料為準，每次測量生長性狀的操作是在室內進行，并且提前準備足夠的冰水，盡量減少高溫對草魚的損傷。魚類標記一般常用的方法有掛牌、剪鰭、染料標記、熒光標記、電子標記等標記技術，本試驗使用的剪鰭標記，相對于其他標記有操作簡單、保留時間持久、對魚傷害小等優點，李思發等[31]研究了剪鰭標記部位對吉富羅非魚生長的影響，指出剪左胸、右胸、左腹和右腹鰭標記的魚之間以及剪不同標記的魚與未剪鰭標記的魚之間的生長無顯著差異。

圖3 家系3和家系4 MSTN1基因部分序列SNP位點篩選Fig.3 SNP site selection of partial sequence of MSTN1 in family 3 and family 4

圖4 家系3和家系4 MSTN2基因部分序列SNP位點篩選Fig.4 SNP site selection of partial sequence of MSTN2 in family 3 and family 4

3.2 家系生長差異分析

從平均體質量和絕對質量增加率來看，經過175 d的養殖，家系4在這兩方面具有明顯的優勢，而家系3生長優勢最弱，從4個家系各個生長性狀對比可知，家系4明顯處于優勢地位。從各個性狀與質量的相關程度的角度分析，每個家系的主要相關性狀有所區別，家系1中相關系數最高的是尾柄長(0.619)，其次是體長(0.619)；家系2中相關系數最高的是頭長(0.687)，明顯高于全長、體長、體厚；家系3中相關系數最高的是全長(0.529)；家系4中全長、體長、體厚的相關系數相近。形態比例性狀在魚類分類中是一個很重要指標，慶寧等[32]通過形態比例性狀對華南沿海地區西部不同水系的中間黃顙魚(P.intermedius)群體進行了有效分類。本研究通過因子分析將多個相關的形態指標轉換為新的、個數較少且相互獨立的綜合指標，通過4個家系個體在第一、二主成分因子得分系數圖可以有效區分家系4和家系3，由此可以看出家系4的生長性狀相對于家系3具有明顯的生長差異。

3.3 MSTN基因在ENU誘變草魚家系的SNP多態性

ENU溶液浸泡精子可在草魚中實現高效誘變，在誘變育種領域具有潛在的應用前景。前期研究顯示，ENU主要誘變草魚基因組DNA產生GC到AT，或者AT到GC的點突變，可造成密碼子的無義突變、錯義突變和同義突變，ENU對上述草魚基因組的平均誘變率為0.41%[7]。本試驗選取的4個ENU誘變草魚家系均是具有顯著生長優勢的個體。通過對MSTN1、MSTN2基因初篩選出不同的SNP位點，對于MSTN1基因，家系3和家系4均在465位點C/G發生錯義突變，家系3還在467位點G/A發生錯義突變。對于MSTN2基因，家系3、4均在912位點C/T發生同義突變，家系3在1027位點G/A產生錯義突變，而家系4在366位點A/G產生錯義突變。由此推測，家系3和家系4產生的顯著生長差異，與MSTN基因的SNP位點差異導致編碼的氨基酸不同，使該基因功能表達差異有聯系，因此家系3和家系4可作為試驗材料來研究MSTN基因相關分子標記的開發，為后續的ENU誘變草魚的分子標記輔助育種奠定基礎。