褐牙鲆白細胞介素21基因克隆及表達分析

薛婷婷，鄭津輝，周 密，潘寶平，孫金生，高 虹

( 天津師范大學 生命科學學院，天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387 )

褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)又稱比目魚，屬鰈形目、牙鲆科、牙鲆屬。近年來，隨著養殖規模和養殖密度的大幅度提升，養殖環境日趨惡化，其在養殖的過程中極易受到病毒、細菌等多種病原體的侵染。遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)屬革蘭氏陰性菌，不僅能使較多經濟魚類患病，給水產養殖業造成嚴重經濟損失，而且也是一種人、魚共患的病原菌[1-2]，直接威脅人類健康，目前尚未創建針對遲鈍愛德華氏菌的商業化防治措施。因此，全面深入的探討研究水產魚類關于該病原菌免疫應答的相關分子機制，將為建立一種有效、能夠預防和控制遲鈍愛德華氏菌感染的免疫防治新措施提供理論基礎[3]。

白細胞介素21(IL-21)是近幾年被發現并引起廣泛關注的一個細胞因子，白細胞介素21大部分來自活化的CD4+ T、NKT細胞，和白細胞介素2、白細胞介素4以及白細胞介素15具有高度同源性，廣泛分布在T細胞、B細胞、巨噬細胞和角質化細胞等一系列細胞外部。白細胞介素21受體廣泛分布表達于各種器官(心、肝、脾、頭腎、肌、腸)的細胞表面，細胞表面的受體結合后可以分泌細胞因子、炎癥因子和趨化因子等，可以參與多重機體免疫調節[4-8]。目前，對白細胞介素21的免疫生物學功能、受體及相關的信號通路研究主要集中在哺乳動物[9-19]，非哺乳動物中白細胞介素21的研究很少，因此，研究魚類白細胞介素21對自身免疫的作用尤為重要。近年來，項黎新等[20-21]先后利用比較基因組學等方法，在紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)中鑒定了白細胞介素2和白細胞介素21的同源基因，表明在生物進化中，白細胞介素2細胞因子家族在魚類中就已開始出現，王惠菊[22]研究發現，白細胞介素21基因在黑青斑河鲀(Tetraodonnigroviridis)、紅鰭東方鲀以及人類中具有保守的共線性。

本研究以褐牙鲆及遲鈍愛德華氏菌作為研究材料，探討魚類免疫因子白細胞介素21基因應答遲鈍愛德華氏菌入侵的免疫機制，以加深對魚類免疫系統調節機制的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚

健康褐牙鲆購于天津市濱海新區某水產養殖場，挑選生長發育狀態優良的褐牙鲆6尾(試驗組、對照組每組分別各3尾，設3個平行對照)，體長(10±2) cm，選擇可供氧、控溫和水過濾的水循環魚缸，鹽度17～18，水溫約20 ℃，充氧處理7 d，使褐牙鲆充分適應環境，并對魚缸進行遮光處理，日投喂1次[1-2,23]。

1.1.2 病原體

試驗所用遲鈍愛德華氏菌，由天津市水產養殖病害防治中心提供，本實驗室保存。將保存的菌種接種于LB液體培養基上，恒溫振蕩培養至菌液600 nm吸光值(OD600)為1.0。磷酸緩沖鹽溶液離心洗滌菌體3次，將菌液密度調至1×107個/mL。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和純化

取急凍好的組織置于提前用液氮冷卻完成的玻璃勻漿器中，滴加1 mL Trizol，進行充分研磨后，按照Trizol(Invitrogen)說明書中提供的方法提取總RNA。Na-nodrop檢測總RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳檢驗完整度，將提取的RNA存放于冰箱-80 ℃備用。

1.2.2 cDNA第一鏈的合成

購于Sangon Biotech?公司的cDNA 試劑盒，按照其推薦的方法，用于cDNA第一鏈的合成。

1.2.3 褐牙鲆頭腎組織轉錄組測序

轉錄組測序由北京諾禾致源生物信息科技有限公司提供技術服務。測序平臺為Illumina HiSeqTM2500。

1.2.4 IL-21基因編碼區序列的克隆

根據褐牙鲆轉錄組測序結果得到褐牙鲆白細胞介素21類似cDNA基因序列，對該序列進行閱讀框分析后，設計引物，利用PCR方法對蛋白質編碼區域的基因序列進行克隆。引物見表1中的IL21-R和IL21-F。PCR擴增反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 10 min[24-29]。擴增的目的片段用試劑盒回收后，連接到pMD18-T 載體上，轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態細胞，于37 ℃培養過夜。進行藍白斑篩選和菌液PCR鑒定[30]，將陽性克隆擴增產物送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行測序。

1.2.5 生物信息學分析

利用ORF軟件 (http:∥www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorf.html)查找目的基因的開放讀碼框；利用BLAST(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、ClustalX 及DNAstar中的MegAlign等軟件完成序列的比對及生物信息學分析;使用Compute pI-Mw (http:∥web.expasy.org/compute_pi/)計算蛋白質等電點和相對分子質量；使用SMART程序分析氨基酸的結構，SignalP 4.1 Server進行信號肽的預測。使用Mega 5進行系統發育樹的構建。

1.2.6 遲鈍愛德華氏菌脂多糖提取

將90%苯酚溶液于66 ℃水浴預熱10 min，加入到10 mL密度為1×107個/mL的遲鈍愛德華氏菌菌液中，室溫下攪拌25 min并冷卻，放入冰箱凍存一晚，翌日取出，5000 r/min離心15 min，吸取上清液保留。剩下的殘渣和酚層加入10 mL水，66 ℃水浴加熱30 min，離心，吸取上清液。將兩次吸取的上清液加入到0.85%的氯化鈉溶液中進行透析，得到粗脂多糖，將得到的粗脂多糖用聚乙二醇提純[31]。

1.2.7 褐牙鲆免疫

將購買的同一批生長狀態、規格一致的健康褐牙鲆[體長(10±2) cm]，隨機分到兩組魚缸，第一組每尾腹腔注射100 μL提取的遲鈍愛德華氏菌脂多糖，第二組作為對照組，每尾腹腔注射磷酸緩沖鹽溶液100 μL[32]。每組魚在各時間點隨機抽取3尾進行解剖并分離各組織細胞，將每3尾魚的相同組織混拌均勻，置于同一凍存管中保存備用。

1.2.8 基因表達相對定量分析

使用ABI 7500熒光PCR儀，使用 Promega?公司的GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒推薦的方法，以反轉錄的cDNA為模板，β-actin為內參基因，進行熒光PCR反應，獲得各組織的免疫相關基因的相對定量表達數據[所用引物見表1中的IL21-F-q和IL21-R-q；MyD88-F-q(MyD88為髓樣分化因子)，MyD88-R-q和β-actin-F-q，β-actin-R-q]。反應體系(24 μL):cDNA模版4 μL，上游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，下游引物(10 μmo l/L) 0.4 μL，GoTaq?qPCR Master Mix 10 μL，Nuclease-Free Water 9.2 μL。各組織樣品設3個平行，用2ΔΔCt的方法進行相對定量分析，用Origin 8軟件作柱狀圖分析。

1.2.9 褐牙鲆頭腎淋巴細胞分離

市場購買的健康褐牙鲆，體質量約1 kg，體長約45 cm，使用手術剪斷頸處死，于超凈臺上解剖并分離頭腎組織。將一個200目的無菌不銹鋼篩置于含L-15培養基的培養皿上，培養基內含10%小牛血清、肝素10 U/mL、青霉素100 μg /mL及鏈霉素100 U /mL。用玻璃注射器針芯將頭腎組織在不銹鋼篩上輕輕研磨直至成細胞懸液，再用針頭吹打懸液，使細胞分散為單個細胞。將所得頭腎單細胞懸液小心鋪于密度為1.0770 g/cm3的Ficoll分離液上，1500 r/min水平離心30 min，得到4層溶液，用針頭小心將第二層的淋巴細胞吸出，細胞用培養液離心洗滌3次，臺盼藍染色后計數活細胞，調節細胞密度為105個/mL，分裝于96孔板上，每孔100 μL，置CO2培養箱內25 ℃恒溫培養[30]。

表1 試驗所用引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in qRT-PCR experiments

1.2.10 RNA干擾試驗

用于沉默MyD88基因的siRNA (小干擾RNA，CCAGAGCGACTTTGAATTT)由廣東銳博生物有限公司設計并合成。將100 μL褐牙鲆頭腎淋巴細胞加入96孔培養板中，將0.25 μL siRNA的稀釋液和1.6 μL轉染試劑稀釋液混合均勻后加入每孔中(對照組為0.25 μL control siRNA的稀釋液)，25 ℃培養3 h后，每孔加入2 μL質量濃度為10 mg/mL的脂多糖免疫刺激細胞，分別于不同時間點取樣，每個時間點3個平行。由于基因沉默預試驗顯示，在3 h后MyD88的表達量開始降低，5 h達到最低，因此，試驗設計在加入siRNA之后的3 h時，再加入脂多糖進行免疫刺激。

2 結果與分析

2.1 褐牙鲆白細胞介素21基因編碼序列的分析

轉錄組測序結果得到褐牙鲆白細胞介素21 cDNA相似序列長度為1606 bp，已經提交到 GenBank，登錄號KY783929。開放閱讀框分析顯示，該序列含有全部蛋白編碼序列(cds)。根據轉錄組測序信息，設計引物通過PCR克隆了編碼序列區域的全部序列，進行測序驗證。對克隆的編碼序列分析表明，讀碼框從起始密碼子(ATG)開啟，末尾以終止密碼子(TGA)結束，表明該段cDNA序列包含完整的蛋白序列。褐牙鲆白細胞介素21基因開放閱讀框區全長429 bp，一共編碼142個氨基酸，蛋白質的理論等電點為9.13，分子量16.018 ku。利用SignalP 軟件分析，發現白細胞介素21在N端存在19個氨基酸殘基的信號肽序列(圖1)。

圖1 褐牙鲆白細胞介素21基因的編碼序列Fig.1 The of coding sequence IL-21 gene in blastard flounder P. olivaceus 起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA)用*表示，灰色陰影部分為信號肽. * denotes initiator codon(ATG)and termination codon(TGA)， and the signal peptide is shaded in gray.

2.2 褐牙鲆白細胞介素21基因編碼蛋白質的同源性及進化分析

褐牙鲆白細胞介素21蛋白序列BLAST比對結果顯示，該蛋白質的氨基酸序列與其他物種白細胞介素21氨基酸序列具有很高的相似度(圖2)。在美國國立生物技術信息中心上搜索已報道的白細胞介素21家族全長氨基酸序列，分別采用鄰接法(圖3)、最大似然法(圖4)和非加權組平均法(圖5)進行分子系統進化樹的構建，3種方法得到一致的結果，褐牙鲆蛋白序列同其他物種的白細胞介素21蛋白序列處在同一進化分支上，在親緣關系上同尖吻鱸(Latescalcarifer)以及深裂眶鋸雀鯛(Stegastespartitus)最近，具有共同進化的祖先和相似的生物學功能。

2.3 褐牙鲆白細胞介素21基因的組織表達模式分析

利用實時熒光PCR方法，以β-actin為內參基因，相對定量地檢測了白細胞介素21在健康褐牙鲆7個重要組織器官(心臟、肝臟、脾臟、頭腎、肌肉、腸道、鰓)中的表達分布(圖6)。研究結果表明，白細胞介素21基因廣泛表達于所檢測的褐牙鲆各組織中，但表達量存在差異，白細胞介素21在肝臟中的表達量最高，小腸次之，因此，白細胞介素21基因在褐牙鲆組織中的表達具有廣泛性和特異性。

2.4 遲鈍愛德華氏菌脂多糖刺激下褐牙鲆白細胞介素21基因的表達譜

試驗用提取的遲鈍愛德華氏菌脂多糖對褐牙鲆進行免疫刺激，通過實時熒光PCR方法檢測褐牙鲆頭腎、脾臟組織中白細胞介素21基因的表達變化(圖7)。白細胞介素21基因在脾臟組織中6 h時表達量開始升高，在12 h的時候達到最大值，為對照組25倍(P<0.01)；在頭腎組織中的表達量自1 h時表達量開始上升，但變化不顯著，在6 h時達到最大值，為對照組5倍(P<0.01)。由此可見，脾臟中的應答反應強于頭腎。

圖2 褐牙鲆白細胞介素21與其他物種白細胞介素21 氨基酸序列比對Fig.2 Comparison of amino acid sequence alignment of IL-21 in blastard flounder P. olivaceus with IL-21 in other species 尖吻鱸，登錄號：XM_018703016.1；深裂眶鋸雀鯛，登錄號：XM_019258432.2；褐牙鲆，登錄號：KY783929；尼羅羅非魚，登錄號：XM_025910006.1；伯氏樸麗魚，登錄號：XM_014334141.1；慈鯛魚，登錄號：XM_013909155.1；大黃魚，登錄號：XM_019258432.2. Lates calcarifer, accession number: XM_018703016.1; Stegastes partitus, accession number: XM_019258432.2; Paralichthys olivaceus, accession number: KY783929; Oreochromis niloticus, accession number:XM_025910006.1; Happochromis burtoni, accession number:XM_014334141.1； Pundamilia nyererei, accession number:XM_013909155.1; Larimichthys crocea, accession number:XM_019258432.2.

圖3 鄰接法構建白細胞介素21序列進化系統樹Fig.3 The phylogenetic tree of IL-21 by neighbor-joining method 比例尺代表每個殘基的替代率，位于節點上的數字表示置信度，重復次數為1000，下同. The scale bar represents replacement rate of each residue. Numbers on nodes represent confidence level of 1000 bootstrap replicates. et sequentia.

圖4 最大似然法構建白細胞介素21序列進化系統樹Fig.4 The phylogenetic tree of IL-21 gene sequence by MLE

圖5 非加權組平均法構建白細胞介素21序列進化系統樹Fig.5 The phylogenetic tree of IL-21 gene sequence by UPGMA

圖6 褐牙鲆白細胞介素21基因在健康褐牙鲆中的組織表達Fig.6 The relative expression of IL-21 in different tissues of healthy bastard flounder P. olivaceus

圖7 遲鈍愛德華氏菌脂多糖刺激褐牙鲆后 白細胞介素21基因的表達Fig.7 The gene expression of IL-21 in blastard flounder P. olivaceus stimulated by E. tarda LPS

2.5 褐牙鲆白細胞介素21與Toll樣受體信號通路的關聯性

為了檢測白細胞介素21與Toll樣受體(TLR)信號通路是否存在相關性，試驗以原代培養的褐牙鲆頭腎淋巴細胞為材料，采用RNA干擾技術將Toll樣受體信號接頭分子MyD88基因進行沉默，檢測白細胞介素21的表達變化[33-34]。Toll樣受體是一種膜受體，可識別入侵微生物的保守結構分子，啟動機體固有免疫。MyD88是一種接頭蛋白，含有TIR結構域，可與膜受體的TIR域作用，向下游傳遞信號，因此是TLR信號通路中的關鍵接頭分子，具有信息傳遞的承上啟下作用[35-37]。siRNA是一種短片斷雙鏈RNA分子，能夠與序列同源互補的靶mRNA特異性結合，誘導靶mRNA發生降解，從而使靶mRNA沉默。試驗結果顯示，褐牙鲆頭腎淋巴細胞經MyD88的siRNA基因干擾作用后，MyD88的表達量在2 h開始降低，在5 h時干擾效果最明顯，表達量降至對照組的1/3(圖8)。同時，白細胞介素21的表達量檢測到在第4 h降低，第5 h降至最低(圖9)，變化趨勢與MyD88一致，說明白細胞介素21基因的表達也同樣受到了抑制。試驗中于第3 h加入提取的遲鈍愛德華氏菌脂多糖對基因沉默后的細胞進行免疫刺激，則MyD88和白細胞介素21基因的表達量從第6 h開始逐漸回升，表明這兩個基因對遲鈍愛德華氏菌脂多糖都產生了應答反應。結果暗示，白細胞介素21與MyD88可能存在一定關聯性。

3 討 論

白細胞介素21作為近期發現的調節因子，受到廣泛重視，已有大量關于白細胞介素21的研究。胡春蓉等[38]發現，白細胞介素21會加速慢乙肝患者HBeAb形成，會促進B淋巴細胞的擴增，在慢乙肝臨床轉歸過程中的作用也具有重要臨床價值；鈕曉音等[39]發現，白細胞介素21通過上調白細胞介素17的表達參與了Graves的發病機制，且這一機制可能并不依賴于甲狀腺功能，而與自身免疫過程相關，還發現白細胞介素21在類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、炎癥性腸病、系統性硬化病等多種免疫過強型病疫的發病機制中發揮著極為關鍵的作用；項黎新等[21]利用脂多糖誘導黑青斑河鲀，發現白細胞介素21在頭腎和脾臟中表達出現明顯的上升，表明白細胞介素21很可能是一個炎癥因子，參與感染免疫過程。然而目前，對白細胞介素21的相關研究主要集中在哺乳動物，非哺乳動物中白細胞介素21的研究很少，而關于褐牙鲆白細胞介素21基因的研究至今尚未見報道。

圖8 MyD88基因沉默后脂多糖刺激下MyD88基因的表達Fig.8 The expression of MyD88 stimulated by LPS by silencing MyD88

圖9 MyD88基因沉默后脂多糖刺激下白細胞介素21基因的表達Fig.9 The expression of IL-21 stimulated by LPS silencing MyD88

3.1 褐牙鲆白細胞介素21基因的組織表達模式分析

有研究表明，在黑青斑河鲀中白細胞介素21僅在腸、鰓和性腺組織中發現有少量表達,作為魚類主要免疫器官的頭腎和脾臟反而未發現有表達；在紅鰭東方鲀中，僅健康魚體的頭腎中有少量表達；而在哺乳動物如牛和小鼠,正常組織中不表達[22]。本試驗中，健康褐牙鲆組織表達量結果顯示，在褐牙鲆中白細胞介素21基因具有組織表達的特異性，在肝臟組織表達量最高，在脾臟、頭腎中的表達量并不是很高，這可能是因為頭腎和脾臟是魚類極為重要的免疫器官，白細胞介素21作為一類重要的免疫細胞因子，在重要免疫器官的表達量較其他器官明顯偏高，而白細胞介素21在肝臟中表達量最高，這可能是因為肝臟中儲存大量的肝糖原，是重要的代謝器官。由此可見，白細胞介素21在不同生物不同組織中的表達有差異。

3.2 褐牙鲆白細胞介素21基因對病原體刺激下的免疫應答反應

使用脂多糖進行刺激，試驗組白細胞介素21的表達量出現了明顯的上升，說明脂多糖刺激誘導了白細胞介素21的表達，這與轉錄組測序結果相似，也和實驗室前期工作不矛盾。已有研究表明，脂多糖誘導黑青斑河鲀白細胞介素21基因在頭腎和脾臟的表達量較高，在鰓、腸道和皮膚中也有少量表達[21]，這與本研究結果基本一致。白細胞介素21基因表達量上升，原因可能是白細胞介素21是一個炎癥因子，和B細胞的增殖有關，B細胞作為獲得性免疫過程中非常關鍵的一種免疫細胞，參與其中的免疫反應，在機體清除病原體的過程中，B細胞會大量增殖，所以白細胞介素21的表達量升高，由此可見，白細胞介素21參與了褐牙鲆的免疫調節過程，是一類重要的免疫因子，在遲鈍愛德華氏菌致病性方面極為關鍵，這一結果為確定白細胞介素21基因免疫功能研究病原體的選擇以及制備褐牙鲆細胞組織的選擇提供了理論依據。

3.3 褐牙鲆白細胞介素21與Toll樣受體信號通路的關聯性

Toll樣受體作為重要的病原相關分子模式識別受體家族成員之一，可通過Myd88依賴型信號通路激活機體的免疫應答反應，激活下游的調控因子NF-κB或AP-1，傳導免疫信號，促進前炎癥因子(如白細胞介素6、白細胞介素8、白細胞介素12和TNF的表達)的釋放，進而誘導白介素、干擾素等刺激細胞生成效應分子最終殺死外來病原微生物活化轉錄因子，進而對疾病進行防衛、抵御和控制，是一類參與非特異性免疫非常重要的蛋白質分子[40-43]，白細胞介素位于TLRs下游信號通路中，在傳遞信息，激活與調節免疫細胞，介導免疫細胞活化、增殖、分化及炎癥反應中均起到舉足輕重的作用，白細胞介素21信號途徑在眾多免疫細胞內均有表達，能夠增強細胞的特異性反應。項文清[44]研究發現，在各免疫細胞內的作用過程中,肝細胞內通過增強MyD88的表達,從而部分增強其下游通路的激活通過激活MyD88-IRAK通路來增強炎癥因子白細胞介素6的表達。本試驗中通過siRNA干擾的手段研究褐牙鲆頭腎細胞在MyD88基因沉默的條件下白細胞介素21的表達量變化情況，發現MyD88的表達量和對照組相比表達量明顯降低，說明得到的 MyD88雙鏈 RNA成功沉默了 MyD88的表達，與此同時，白細胞介素21的變化趨勢與MyD88的變化趨勢基本一致，MyD88基因被沉默后， 白細胞介素21基因的表達量也發生了明顯的降低；在加入脂多糖免疫刺激后，又開始逐漸上升，變化趨勢與MyD88一致，與其他學者研究結果相同，表明白細胞介素21同白細胞介素6相似，與MyD88在功能上具有一定關聯性，暗示著白細胞介素21基因的表達受到MyD88的調控。這是因為白細胞介素21的表達受到TLRs信號通路的調節，MyD88作為Toll樣受體信號通路中的一個接頭分子，在傳遞上游信息和疾病發生發展中具有重要的作用[41-43]，所以當MyD88表達被干擾后，Toll樣受體的信號通路會發生阻斷，下游的免疫基因白細胞介素21的表達量也會隨之減弱，當再加入脂多糖進行免疫刺激時，白細胞介素21的表達量與MyD88又開始逐漸上升，與預期一致，驗證了筆者的猜想。

4 結 論

本試驗研究了白細胞介素21在各個健康組織、器官中的轉錄水平，深入探索魚類免疫因子白細胞介素21在應答遲鈍愛德華氏菌入侵的免疫應答過程中的分子機理，通過對比可以看出，白細胞介素21可能在抵抗炎癥反應中有著極為重要的作用。所得結果將有助于加深人們對魚類免疫系統調節機制的全面認識，為建立一種有效的、能夠預防和控制遲鈍愛德華氏菌感染的免疫防治新措施提供理論基礎。