遵義地區(qū)莽椒細(xì)菌多樣性及PICRUSt基因功能預(yù)測分析

崔夢(mèng)君，王玉榮，葛東穎，張振東，劉欣，郭壯

(湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽,441053)

作為我國華中和西南地區(qū)特色傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一，莽椒(又稱莽海椒)的制作工藝相對(duì)粗放，通常將秈米和糯米按照一定的比例混合搗碎成粉，塞入切開去瓤的紅辣椒中入壇密封發(fā)酵一個(gè)星期即可。莽椒的制作環(huán)境相對(duì)開放且加工過程中無殺菌等工藝操作，這使得原料、加工器具和環(huán)境中的微生物得以保留，莽椒的制作方式為厭氧方法，為乳酸菌等厭氧細(xì)菌的生長提供了良好的條件。由此可見，莽椒的品質(zhì)形成與自然微生物的發(fā)酵密不可分，但是目前關(guān)于莽椒微生物多樣性的研究報(bào)道尚少。

與莽椒制作工藝相同，鲊廣椒亦是以秈米和辣椒為主要原料密封發(fā)酵而成，兩者不同點(diǎn)在于鲊廣椒制作工程中通常將辣椒切碎后與秈米混合發(fā)酵[1]。近年來，以Illumina MiSeq為代表的第二代高通量測序技術(shù)廣泛的應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物多樣性的解析中[2-3]，在快速和準(zhǔn)確解析發(fā)酵基質(zhì)微生物多樣性的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了多樣本的平行比較[4-5]。采用該技術(shù)，王玉榮發(fā)現(xiàn)Lactobacillus為湖北省當(dāng)陽地區(qū)鲊廣椒中的優(yōu)勢細(xì)菌[6]。相同的發(fā)酵基質(zhì)，略有差異的制作工藝，莽椒和鲊廣椒中微生物群系是否亦存在差異是值得探討的問題。

本研究從貴州省遵義地區(qū)采集了7 個(gè)莽椒樣品，使用Illumina MiSeq測序技術(shù)對(duì)其細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析，同時(shí)從MG-RAST數(shù)據(jù)庫下載了8 個(gè)采集自湖北省當(dāng)陽地區(qū)鲊廣椒樣品的測序數(shù)據(jù)[6]進(jìn)行比較研究，并采用PICRUSt和BugBase軟件對(duì)兩者細(xì)菌種群的基因功能和表型進(jìn)行了預(yù)測。通過本研究的開展以期為后續(xù)莽椒品質(zhì)改善和安全性提升提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

莽椒樣本采集自貴州省遵義市協(xié)臺(tái)壩菜市場和松桃菜市場(106°94′E，27°70′N)，共采集7 個(gè)，編號(hào)依次為MJ1～MJ7。

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒，德國QIAGEN公司；MRS培養(yǎng)基、石蕊牛乳培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；5×TransStartTM FastPfu 緩沖液、FastPfu Fly DNA Polymerase和dNTPs Mix，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DG250型厭氧工作站，英國Don Whitley公司；CR21N型高速離心機(jī)，日本日立金屬株式會(huì)社；vetiri梯度基因擴(kuò)增儀，美國AB公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺(tái)，美國Illumina公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)，美國Nano Drop公司；R920機(jī)架式服務(wù)器：美國Dell公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離鑒定

使用無菌手術(shù)剪將莽椒樣品剪碎，取10 g加入100 mL石蕊牛乳培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)36 h[7]。采用倍比稀釋法將培養(yǎng)物稀釋至10-3～10-6梯度后涂布于MRS培養(yǎng)基(含有1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CaCO3)中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h[8]。從菌落數(shù)為30～300的平皿中挑選含有透明圈且形態(tài)不同的菌落純化3 次后，將過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陰性、革蘭氏染色陽性的菌株暫定為疑似乳酸菌菌株。參照文獻(xiàn)[8]中方法，采用CTAB法對(duì)疑似乳酸菌菌株的DNA進(jìn)行提取，并對(duì)其16S rRNA全序列進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行清潔，并將其連接到T載體后轉(zhuǎn)化至Escherichiacolitop10 中，陽性克隆子寄往測序公司進(jìn)行測序，反饋回的序列拼接后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 宏基因組DNA提取和Illumina MiSeq測序

使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒對(duì)莽椒樣品進(jìn)行宏基因組DNA提取，使用帶有7個(gè)堿基核苷酸標(biāo)簽(barcode)的338F/806R引物，按照文獻(xiàn)[9]中的PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測合格后的擴(kuò)增產(chǎn)物使用Illumina MiSeq PE300高通量測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。

1.3.3 序列質(zhì)控和生物信息學(xué)分析

參照文獻(xiàn)[10]中的方法對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)拼接后進(jìn)行質(zhì)控，將錯(cuò)配率≥0.2、引物堿基錯(cuò)配數(shù)≥2 bp或barcode堿基有錯(cuò)配的予以剔除，進(jìn)而篩選得到高質(zhì)量的序列集。以QIIME(v1.70)平臺(tái)為依托[11]，使用PyNAST軟件對(duì)序列進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)和對(duì)齊[12]；選取100%和97%相似度進(jìn)行兩步UCLUST劃分，構(gòu)建分類操作單元矩陣(operational taxonomic units，OTU)[13]；使用ChimeraSlayer軟件剔除含有嵌合體序列的OTU[14]；從OTU中選取一條代表性序列，使用GREENGENE、SILVA和RDP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì)[15]，進(jìn)而在門、綱、目、科和屬水平上獲得各OTU的分類學(xué)地位；在使用FastTree軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的基礎(chǔ)上[16]，計(jì)算Chao1指數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)進(jìn)而對(duì)菌群的多樣性和豐度進(jìn)行評(píng)價(jià)；使用UniFrac距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析，進(jìn)而完成遵義地區(qū)莽椒和當(dāng)陽地區(qū)鲊廣椒中細(xì)菌的β多樣性分析。

1.3.4 核酸登錄號(hào)

本研究中所有序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為mgp90774。同時(shí)本研究下載湖北省當(dāng)陽地區(qū)的鲊廣椒序列數(shù)據(jù)納入分析，該數(shù)據(jù)在MG-RAST數(shù)據(jù)庫的登錄號(hào)為mgp80896。

1.3.5 PICRUSt功能預(yù)測和BugBase表型預(yù)測

基于GREENGENE數(shù)據(jù)庫對(duì)質(zhì)控后的高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)進(jìn)行UCLUST劃分和注釋，使用PICRUSt軟件對(duì)莽椒和鲊廣椒樣品中微生物的基因功能進(jìn)行預(yù)測[17]，并依照蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋[18]。將OTU矩陣與樣品的分類信息上傳至BugBase網(wǎng)站(https://bugbase.cs.umn.edu/)進(jìn)行表型預(yù)測[19]。

1.3.6 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Wilcoxon test對(duì)莽椒和鲊廣椒樣本的α多樣性、菌群結(jié)構(gòu)和功能類別進(jìn)行顯著性分析；使用冗余分析對(duì)造成莽椒差異的功能類別進(jìn)行甄別；使用Spearman秩相關(guān)性分析法對(duì)樣本中優(yōu)勢細(xì)菌屬與功能類別之間的相關(guān)性進(jìn)行計(jì)算，選取相關(guān)系數(shù)>0.6，且校正后P<0.05菌群和指標(biāo)，采用Cytoscape軟件進(jìn)行相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。使用R軟件進(jìn)行分析和繪圖；使用Canoco 4.5軟件進(jìn)行冗余分析和繪圖；使用Origin 2017軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 莽椒中乳酸菌的分離鑒定

本研究從7 個(gè)莽椒樣本中共分離出17 株疑似乳酸菌菌株；同時(shí)通過16S rRNA基因序列分析進(jìn)一步將分離菌株鑒定到種水平，分離株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

由圖1可知，本研究分離出的17 株乳酸菌分別鑒定為Weissellahellenica(希臘魏斯氏菌，1 株)、Lactobacillusbrevis(短乳桿菌，1 株)、L.pentosus(戊糖乳桿菌，10 株)、L.plantarum(植物乳桿菌，2 株)、L.alimentarius(消化乳桿菌，1 株)和L.fermentum(發(fā)酵乳桿菌，2 株)。值得注意的是，17 株分離菌中有16 株為乳酸桿菌。

2.2 基于門和屬水平的莽椒中細(xì)菌構(gòu)成分析

本研究使用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對(duì)莽椒中細(xì)菌的多樣性進(jìn)行了解析，共產(chǎn)生295 133 條高質(zhì)量序列，平均每個(gè)樣本產(chǎn)生42 162條。經(jīng)100%和97%劃分和去除嵌合體后共得到10 747個(gè)OTU。莽椒中優(yōu)勢門和屬相對(duì)含量的方格圖如圖2所示。

圖1 基于16S rRNA的17 株乳酸菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 17 strains of lactic acid bacteria and standard strains based on 16S rRNA

a-細(xì)菌門；b-細(xì)菌屬圖2 莽椒樣品中主要細(xì)菌門和屬相對(duì)含量的方格圖Fig.2 The relative content of the main bacterial phylum and genus in the Mangjiao sample

由圖2可知，10 747個(gè)OTU共注釋到16個(gè)門，其中相對(duì)含量>0.1%的分別為硬壁菌門、變形菌門、Bacteroidetes(擬桿菌門)和Actinobacteria(放線菌門)，其平均相對(duì)含量分別為63.15%、36.24%、0.30%和0.12%。由此可知，莽椒中的細(xì)菌主要隸屬于硬壁菌門和變形菌門，而王玉榮的研究表明鲊廣椒中的細(xì)菌亦主要隸屬于硬壁菌門(62.36%)和變形菌門(25.97%)[6]。

由圖2亦可知，10 747個(gè)OTU共注釋到249個(gè)屬，其中相對(duì)含量大于1.0%的分別為乳桿菌屬(41.37%)、假單胞菌屬(16.64%)、魏斯氏菌屬(14.96%)、腸桿菌屬(5.04%)、片球菌屬(2.48%)、克雷伯氏菌屬(2.40%)和芽孢桿菌屬(1.33%)，而王玉榮的研究表明鲊廣椒中含量大于1.0%的細(xì)菌屬也有7個(gè)，分別為乳桿菌屬(77.33%)、魏斯氏菌屬(2.24%)、片球菌屬(2.18%)、葡萄球菌(1.27%)、Carnimonas(肉胞菌屬，5.66%)、腸桿菌屬(2.47%)和Prevotella(普氏菌屬，1.05%)[6]。

2.3 莽椒與鲊廣椒中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的比較

為了進(jìn)一步甄別莽椒和鲊廣椒中微生物類群的差異，本研究將王玉榮研究中涉及的序列從MG-RAST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了下載[6]，并將其與本研究獲取的序列進(jìn)行了歸并，同時(shí)使用QIIME分析平臺(tái)對(duì)兩類樣品的α和β多樣性進(jìn)行了解析，α多樣性指數(shù)的比較箱型圖如圖3所示。

a-Cheol指數(shù)；b-發(fā)現(xiàn)物種數(shù)；c-Simpson指數(shù)；d-Shannon指數(shù)圖3 莽椒和鲊廣椒樣品α多樣性指數(shù)的比較箱型圖Fig.3 Comparative boxplots of α diversity index of Mangjiao and Zhaguangjiao samples注：*代表P<0.05；ns代表差異不顯著，P>0.05(下同)

由圖3可知，莽椒中細(xì)菌在Chao1指數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)上均高于鲊廣椒樣本，經(jīng)Wilcoxon test檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Chao1指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)在兩者之間存在顯著性差異(P<0.05)。Chao1指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)常用于對(duì)樣品中微生物的豐度進(jìn)行評(píng)估，其值越大表明微生物豐度越高，由此可知，莽椒中細(xì)菌的豐度顯著高于鲊廣椒(P<0.05)。基于加權(quán)和非加權(quán)UniFrac距離的兩類樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性分析如圖4所示。

由圖4-a可知，在基于加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析圖中，兩類樣品的空間分布存在交疊現(xiàn)象，經(jīng)多元方差分析發(fā)現(xiàn)兩組樣品群落結(jié)構(gòu)差異不顯著(P>0.05)；由圖4-b可知，在基于非加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析圖中，兩類樣品呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢，多元方差分析表明其群落結(jié)構(gòu)差異極顯著(P<0.001)。由此可見，莽椒和鲊廣椒可能均各自含有一些含量較少但較為獨(dú)特的細(xì)菌類群。經(jīng)Wilcoxon test檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，變形菌門、假單胞菌屬和魏斯氏菌屬在莽椒樣品中顯著較高(P<0.05)，而放線菌門和乳桿菌屬顯著較低(P<0.05)。

a-加權(quán)；b-非加權(quán)圖4 基于加權(quán)和非加權(quán)的UniFrac距離的主坐標(biāo)分析圖Fig.4 Principal coordinate analysis diagram of UniFrac distance based on weighted and unweighted

本研究使用BugBase對(duì)莽椒與鲊廣椒樣品中細(xì)菌的表型進(jìn)行了預(yù)測分析，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，移動(dòng)原件含量、生物膜形成、革蘭氏陰性菌、致病潛力和氧化脅迫耐受在莽椒細(xì)菌中顯著偏高(Wilcoxon test發(fā)現(xiàn)，P<0.05)，而革蘭氏陽性菌呈現(xiàn)出相反的趨勢(P<0.05)。由此可見，莽椒與鲊廣椒中的細(xì)菌在預(yù)測表型上存在著較大的差異。

2.4 PICRUSt功能預(yù)測

本研究進(jìn)一步使用PICRUSt軟件對(duì)莽椒與鲊廣椒中細(xì)菌菌群的基因功能進(jìn)行了預(yù)測。在預(yù)測基因功能的同時(shí)，參考蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(clusters of orthologous groups of proteins，COG)對(duì)預(yù)測的功能類別進(jìn)行了注釋。莽椒與鲊廣椒樣本中細(xì)菌功能類別的比較分析如圖6所示。

a-革蘭陰性菌；b-革蘭氏陽性菌；c-致病潛力；d-厭氧；e-好氧；f-兼性厭氧；g-氧化脅迫耐受；h-生物膜形成；i-移動(dòng)原件含量圖5 莽椒與鲊廣椒樣品中細(xì)菌表型結(jié)果的比較分析Fig.5 Comparative analysis of bacterial phenotypic results in Mangjiao and Zhaguangjiao Samples

a-功能類別熱圖；b-功能類別冗余分析；c-顯著性差異功能類別；A-RNA的加工與修飾；B-染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)；C-能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換；D-細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分割；E-氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；F-核苷轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；G-碳水化合物運(yùn)輸和代謝；H-輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；I-脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；J-翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生；K-轉(zhuǎn)錄；L-復(fù)制-重組和修復(fù)；M-細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生；N-細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；O- 翻譯后修飾，蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，伴侶；P-無機(jī)離子運(yùn)輸與代謝；Q-次生代謝產(chǎn)物的合成-轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝；R-一般功能預(yù)測；S-未知功能；T，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；U-細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，分泌和囊泡運(yùn)輸；V-防御機(jī)制；W-真核細(xì)胞的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)；Y-核外結(jié)構(gòu)；Z-細(xì)胞骨架(下同)圖6 莽椒與鲊廣椒中細(xì)菌功能類別的比較分析Fig.6 Comparative analysis of bacterial functional genes in mangjiao and zhaguangjiao samples

本研究從莽椒和鲊廣椒細(xì)菌中共注釋到4 792個(gè)COG，這些COG分別隸屬于23 個(gè)功能類別。由圖6-a可知，碳水化合物的運(yùn)輸與代謝、氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝和轉(zhuǎn)錄在兩類樣品中均高表達(dá)，而細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、RNA的加工與修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞骨架的表達(dá)則相對(duì)較低。由圖6-b可知，通過冗余分析發(fā)現(xiàn)有12 個(gè)功能類別對(duì)莽椒和鲊廣椒細(xì)菌多樣性的區(qū)分有影響。由6-c所示，3 個(gè)功能類別在莽椒和鲊廣椒樣品中存在顯著性差異(P<0.05)，莽椒樣品中細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸較強(qiáng)，而鲊廣椒中細(xì)菌的細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分割和翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生的表達(dá)較強(qiáng)。兩類樣品中主要菌屬(平均相對(duì)含量大于0.1%)與功能類別之間的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖如圖7所示。

圖7 主要菌屬與功能類別之間的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Correlation network diagram between dominant bacteria and functional classes注：實(shí)線表示顯著正相關(guān)，虛線表示顯著負(fù)相關(guān)；連線的粗細(xì)表示相關(guān)性的大小，線越粗相關(guān)性也大，反之越小

由圖7可知，乳桿菌屬、Salmonella(沙門氏菌屬)、腸桿菌屬、Lactococcus(乳球菌屬)和克雷伯菌屬與12 個(gè)功能類別之間具有顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，其中這12 個(gè)功能類別主要隸屬于碳水化合物代謝、核酸代謝和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的功能類別。值得注意的是，除乳桿菌屬與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、胞內(nèi)運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)呈顯著負(fù)相關(guān)外(P<0.05)，其他菌屬與功能類別之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。由此可見，上述菌屬在莽椒品質(zhì)形成方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

3 討論

在現(xiàn)代食品加工產(chǎn)業(yè)中，乳酸菌是生產(chǎn)發(fā)酵乳、泡菜和益生菌制劑等常用的菌種之一，具有應(yīng)用范圍廣、產(chǎn)品種類多和市場產(chǎn)值大的特點(diǎn)[20]。我國學(xué)者圍繞乳酸菌菌株的挖掘、收集、高密度發(fā)酵、功效評(píng)價(jià)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用開展了大量卓有成效的研究，極大地促進(jìn)了我國乳酸菌及相關(guān)食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前我國開展乳酸菌研究的科研院所和高校多集中在東北三省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、新疆維吾爾自治區(qū)、北京市、廣東省、四川省和江浙滬地區(qū)，而位于我國華中地區(qū)的湖北省及西南地區(qū)的貴州省開展乳酸菌相關(guān)研究的較少，且目前產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中使用的乳酸菌菌株多來源自傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品、腸道和發(fā)酵蔬菜制品。以莽椒和鲊廣椒為代表的特色發(fā)酵食品在我國華中及西南地區(qū)較為流行，其發(fā)酵基質(zhì)和發(fā)酵條件與泡菜和乳制品均存在較大差異，通常以大米、玉米和辣椒為主要原料固態(tài)厭氧發(fā)酵而成，因而其中蘊(yùn)含的乳酸菌資源可能較為獨(dú)特和多樣[21]。本研究從遵義地區(qū)莽椒中分離的絕大部分乳酸菌為戊糖乳桿菌，雖其在泡菜[22]和發(fā)酵乳[23]中亦有報(bào)道，但均為非優(yōu)勢乳酸菌。通過采用單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù)，王玉榮等發(fā)現(xiàn)湖北省當(dāng)陽地區(qū)鲊廣椒中的乳酸菌主要為破布子乳桿菌(L.pobuzihii)、食品乳桿菌(L.alimentarius)和費(fèi)斯莫爾德乳桿菌(L.versmoldensis)，而這些細(xì)菌種在其他發(fā)酵食品中報(bào)道亦較少[24]。此外，ZHANG等亦從湖北省當(dāng)陽地區(qū)的鲊廣椒中分離到1株乳酸菌新物種，并將其命名為鲊廣椒乳桿菌(L.zhachiliisp. nov)[25]。由此可見，我國華中及西南地區(qū)以莽椒和鲊廣椒為代表的淀粉基質(zhì)發(fā)酵食品中含有豐富且較為獨(dú)特的乳酸菌群系，因而在對(duì)發(fā)酵食品微生物多樣性進(jìn)行解析的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行乳酸菌菌株收集，對(duì)后續(xù)乳酸菌遺傳多樣性研究和產(chǎn)業(yè)化推動(dòng)具有積極的意義。

MiSeq測序結(jié)果顯示，乳桿菌屬和魏斯氏菌屬是莽椒樣品中的優(yōu)勢菌屬，分別占到全部細(xì)菌含量的41.37%和14.96%。乳桿菌在莽椒的發(fā)酵過程中可以將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳酸，同時(shí)伴隨著乙醇、乙酸和NO2等各種副產(chǎn)物的生成，不僅使莽椒形成了特有的風(fēng)味，對(duì)雜菌和有害菌亦有一定的抑制作用。作為異型發(fā)酵乳酸菌，魏斯氏菌的主要代謝產(chǎn)物為乳酸和乙酸，有研究表明其可產(chǎn)生寡糖和胞外多糖(主要是葡聚糖)，而這些物質(zhì)可存在于發(fā)酵制品中為人類所利用[26]。本研究亦發(fā)現(xiàn)莽椒中存在大量的條件致病菌，腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬細(xì)菌的占比達(dá)7.44%，通過基因功能預(yù)測亦發(fā)現(xiàn)莽椒中細(xì)菌具有較強(qiáng)的生物膜形成和致病潛力，究其原因在于莽椒的制作環(huán)境較為開放，發(fā)酵過程中極易受到家畜糞便和污水的污染。由此可見，在改善加工環(huán)境的同時(shí)，積極篩選具有優(yōu)良發(fā)酵特性的乳酸菌進(jìn)行莽椒的純種發(fā)酵，對(duì)推動(dòng)莽椒的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程及提升食品安全性具有積極的意義[27]。

通過基因功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，莽椒和鲊廣椒中細(xì)菌的碳水化合物運(yùn)輸與代謝功能均較強(qiáng)，究其原因可能在于兩者制作工藝較為相似，均以大米、玉米和辣椒為主要原料。雖然莽椒和鲊廣椒制作均為厭氧發(fā)酵，但基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)莽椒和鲊廣椒中細(xì)菌均含有較多的兼性厭氧菌且其氧化脅迫耐受能力亦較強(qiáng)，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是居民開壇取食食材時(shí)破壞了罐內(nèi)的厭氧環(huán)境，氧氣的進(jìn)入對(duì)細(xì)菌的多樣性產(chǎn)生了影響。本研究發(fā)現(xiàn)遵義地區(qū)莽椒和當(dāng)陽地區(qū)鲊廣椒均各自含有一些含量較少但較為獨(dú)特的細(xì)菌類群，生產(chǎn)環(huán)境和制作工藝對(duì)發(fā)酵食品的細(xì)菌多樣性具有顯著影響，近年來越來越多的研究表明，不同地區(qū)的發(fā)酵食品不僅微生物群系存在較大差異[28]，同一乳酸菌種種內(nèi)的遺傳多樣性亦存在很大不同[29]。由此可見，在后續(xù)研究中進(jìn)一步擴(kuò)大莽椒和鲊廣椒的樣本采集范圍和數(shù)量，在采用宏基因組學(xué)策略對(duì)其微生物多樣性進(jìn)行揭示的基礎(chǔ)上，使用多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing, MLST)和比較基因組學(xué)手段對(duì)乳酸菌分離株遺傳多樣性進(jìn)行解析是極為必要的。