環二肽的研究進展

魏貴香

摘 ? ? ?要：環二肽是自然界中最簡單的肽類衍生物，其通過兩個氨基酸縮合形成。環二肽骨架是相對穩定的六元環結構并且有兩個氫鍵供體和兩個氫鍵受體，這使得環二肽能夠與多種受體結合，表現出廣泛的生理活性。對近年來環二肽的分布、化學合成以及生物合成途徑進行了介紹。

關 ?鍵 ?詞：環二肽;分布;化學合成;生物合成

中圖分類號：TQ 041 ? ? ?文獻標識碼： A ? ? ?文章編號： 1671-0460（2020）02-0406-04

Abstract： ?Cyclic dipeptide is the simplest peptide derivatives in nature that is formed by condensation of two amino acids. The cyclic dipeptide skeleton is a relatively stable six-membered ring structure with two hydrogen bond donors and two hydrogen bond receptors， which enables the cyclic dipeptide to bind to a variety of receptors and shows a wide range of physiological activities. In this article， the distribution， chemical synthesis and biosynthesis of cyclic dipeptides were briefly described.

Key words： ?cyclic dipeptides; ?distribution; ?chemical synthesis; ?biosynthesis

環二肽通過兩個氨基酸酰胺內環化而成，母體為2，5-二酮哌嗪或2，5-二氧哌嗪，是已知的最小的、結構最簡單的環肽（圖1）。它的命名由每個氨基酸英文名字的前三個字母組成，加上一個表示絕對構型的前綴，如Cyclo（L-Xaa-L-Yaa）。在結構上，環二肽具有兩個氫供體和氫受體，使其表現出較高的可激活酶或蛋白質特定結合位點的潛力，因而成為藥物化學中重要的藥效基團[1]。其穩定的六元環結構和剛性空間構象使其具有廣泛的生理活性，這引起了許多學者的極大興趣。此外，由于類似藥物狀和易被修飾的分子結構并可作藥物分子設計中的藥物分子片段，因此，環二肽在尋找蛋白作用受點和藥物靶標方面具有重要的意義。

1 環二肽在自然界中的分布

環二肽類化合物種類繁多且來源廣泛，據統計其90%由革蘭氏陰性菌產生[2]， 它們也分離自革蘭氏陽性菌、真菌、植物和動物[3]。Curtius等在1888年首次合成了第一種環二肽Cyclo（Gly-Gly）[4]。在以后的十多年里，許多諸如Cyclo（Gly-Gly）的簡單的環二肽逐漸被合成或者從蛋白質及多肽水解產物、微生物、動植物中發現，但其唯一的目的是探索它們有趣的物理化學性質[5]。直到20世紀早期[6-8]，它特殊的生物學功能才開始引起研究學者的廣泛關注，隨著對環二肽研究的重視，其價值逐漸被發現。迄今為止，從海洋和陸地的曲霉、青霉等生態系統的真菌中分離到大量的環二肽及其相關化合物。1960年陳等從真菌病原褐座堅殼菌Rosellinianecatrix中分離得到Cyclo （L-Pro-L-Leu），該化合物對乳腺癌、宮頸癌和結腸癌有不同的抑制作用，同時還有免疫活性、調節激素及調控能量代謝的作用[9]。近年來，也從真菌中分離出許多環二肽類化合物，例如，2014年從海洋真菌Neosartoryapseudofischeri中分離到兩種新的環二肽，neosartins A和neosartins B，以及六種已知的環二肽[10];2016年從海綿相關真菌Neossatoryaglabra中發現了一種新的fellutanine A的類似物[11];2017年從恒山黃芪內生真菌 Aspergillus sp. 中分離出對前列腺癌有較強抑制作用的Cyclo（L-Phe-L-Ala）[12];2018年邱玲等從冬蟲夏草中分離出Cyclo（L-Pro-L-IIe）和Cyclo （L-Pro-L-Val）[13]。

環二肽也從許多細菌中被發現，例如從海洋芽孢桿菌的培養液中，分離到兩種新的環二肽衍生物，cyclo （L-Pro-L-Tyr）和cyclo （L-Pro-L-Val）[14]，從Oscheius屬的病原線蟲中提取的芽孢桿菌提取液中，分離得到具有抑制花生曲霉菌種能力的Cyclo（L-Pro-L-Met）、Cyclo（D-Pro–L-Phe）、Cyclo（L -Pro-L-Phe）、Cyclo（L-Pro-D-Tyr）和Cyclo （D-Pro-L- Tyr）[15]，從北極海洋細菌Pseudoalteromonas sp.分離出對番茄專化型尖孢鐮孢有較強抑制作用的Cyclo（L-Pro-L-Tyr）[16]。同樣，從也從蘇云金桿菌、內生菌[17]等細菌中分離出結構豐富的環二肽。此外有一種古細菌（伊斯巴尼亞鹽陸生菌）也產生環二肽[18]。

活性較好的環二肽通常存在于人和動物體內。例如Cyclo（His-Pro）是第一個由下丘腦促甲狀腺激素釋放激素的氨基端焦谷氨酸殘基水解的內源性環二肽，它普遍存在于人和動物體的中樞神經系統、體液及組織中，并且是與神經保護密切相關的有機陽離子轉運蛋白的關鍵底物。與傳統的不能治療神經炎癥的抗炎療法相比，它可以穿過血腦屏障進入大腦中通過調節Nrf2/NF-κB信號通路介導不同的炎癥和應激反應[19]。作為一種血腦屏障滲透性藥物，Cyclo（His-Pro） 可以通過腸外和口服途徑給藥，從而可提高患者的依從性。實驗表明，Cyclo（His-Pro） 也可通過Nrf2/HO-1途徑抑制百草枯在大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞中誘導的NF-κB核積累[20]。此外，Cyclo（His-Pro）還具有一定的抗酒精麻醉[21]、抗糖尿病[22]、預防肥胖[23]等作用。螞蟻Pachycondy- laapicalis分泌的Cyclo（ Leu-Phe）可作為自衛或進攻的工具[24]。

除了在真菌、細菌和動物中發現的大量環二肽之外，還在植物中發現了許多簡單的環二肽，例如馬齒莧的地上部分，五味子的果實，掌葉半夏的塊莖、麥冬的塊根[25]以及南方靈芝子實體[26]中都發現了多種結構簡單的環二肽（圖1）。

2 ?環二肽的合成方法

環二肽是一種二聚體，代表了一個常見的自然發生的結構基序。如前所述，具有不同生物活性的環二肽通常從不同生物體中分離，在寡肽合成過程中，它們也經常被作為不需要的副產物或降解產物[27]。目前，合成環二肽的方法主要分為以下兩種：

2.1 ?化學合成法

制備環二肽最簡單的方法就是將游離的氨基酸甲酯密封加熱，但是通常前體需要被保護。二肽酯（存在良好的離去基團）是最古老的合成不對稱環二肽的原料[28]。目前存在很多環肽合成的方法，固相合成法是目前應用最廣泛的方法，其中樹脂類型、保護基團和裂解類型各不相同，常用的樹脂有MBHA，Oxime和PAM 等。樹脂上的活性基團是形成肽鏈的關鍵，活性基團通常為活性氨基，硫醇基，羥基，氯甲基等。正確選擇保護基是其成功的關鍵，常用的保護基為Boc，t-Bu，Fmoc（暫時保護基），Bzl（永久保護基），Tos（側鏈保護基）。合成過程：首先將氨基酸羧基末端通過苯基酯（O-Pac）等共價鍵與樹脂結合，連接在樹脂上的氨基酸的氨基保護基去保護后，與下一個氨基酸的羧基縮合偶聯產生二肽，隨后羧基和氨基保護基去保護，在縮合劑的縮合下形成環二肽骨架，最后將合成的環二肽從樹脂上脫落下來。由于該方法是在樹脂上環化然后分離，避免了分子間的二聚化和多聚化，因此利用該方法合成的環二肽具有較高的產率[29]。

溶液合成法是合成環二肽的經典方法，線性肽成環是分子內的反應，為了避免分子間反應生成的線性或者環狀的二聚化和多聚化，一般它需要在高度稀釋的溶液（10-3～10-4 mol/L）中將游離的線性肽在縮合試劑的縮合下首尾連接成環，或先將其一端（通常為C端）活化再成環。將C端活化成環通常所采用的方法有硫酯法、活潑酯法、輔助成環法和疊氮法等。PAR-2受體激動劑7就是一種通過經典的溶液合成與微波加熱相結合的方法合成的對稱的環二肽，該方法避免了氨基酸α-位的差向異構化[30]。

2.2 ?生物合成法

雖然近年來新分離的天然環二肽的數量有所增加，但這些分子的生物合成途徑在很大程度上仍然存在未知的，而天然產物生物合成的研究是發現化學結構及生物活性多樣性的極為有效的途徑之一。目前已闡明了幾種環二肽的生物合成途徑，一般可分為非酶合成途徑和酶合成途徑[31]。

2.2.1 ?非酶合成途徑

非酶合成途徑是指不需酶的參與肽鏈自身發生環化。上述提到的內源性環二肽Cyclo（His-Pro），在中樞神經系統中，具有多種生物活性。它由促甲狀腺素釋放激素（TRH， pGlu-His-Pro）的前體衍生而來。TRH前體為TRH-Gly （pGlu-His-Pro- Gly），首先被焦谷氨酸氨基肽酶裂解，生成His-Pro-Gly，然后非酶促環化生成Cyclo（His-Pro）。脯氨酸中吡咯環的存在增強了結構的剛性約束，這促進了組氨酸和脯氨酸之間肽鍵的順式構象，有利于環二肽骨架的生成[32]。

2.2.2 ?酶合成途徑

目前研究發現存在兩種不相關的酶催化環二肽的形成，這兩種酶分別是非核糖體肽合成酶（GRPSs）和環二肽合酶（CDPSs）。

（1）GRPSs途徑合成環二肽：目前所發現的環二肽骨架大部分是由GRPSs催化合成的。對于決定某個肽的NRPS基因，在原核生物中通常由一個操縱子組成，在真核生物中則以基因簇的形式存在[33]。GRPSs是目前發現的比較大的多功能酶系，由一系列按特定的空間順序排列的模塊組成，每個模塊具有一組獨特的、負責肽合成過程中特定合成步驟的催化結構域[34]。通常NRPSs由三個必要的結構域組成：腺苷酸化（A）結構域、肽酰載體蛋白（PCP）結構域和縮合（C）結構域。A結構域選擇、活化并加載氨基酸進入PCP域以形成氨酰-S-載體復合物，攜帶氨酰基和肽酰基的載體（第一個肽鍵是帶有兩個氨酰基的載體）結合在C結構域上的特定區域，氨酰-S-載體復合物上的氨基作為親核試劑向進攻肽酰-S-載體復合物肽酰基的酰基，從而形成新的肽酰-S-載體復合物。NRPSs的另一個重要催化單元是硫酯酶（TE）結構域，其作用是通過水解或大環化終止延伸并促進肽從PCP上的解離[35]。形成的新的線性肽酰-S-載體復合物與TE結構域結合以形成肽-O-TE的中間體，隨后該中間體被TE結構域水解釋放或經分子內環化形成環二肽類化合物。NRPSs除含有以上核心模塊外，環二肽骨架可由其他結構域進行進一步的結構修飾，如差向異構（E）和N-甲基化結構域（M）進一步修飾分別合成了Erythrochelin[36]和Cyclomarazines[37]。NRPSs的底物非常廣泛，除了把20種典型氨基酸作為底物外，還能催化安息香酸、4-硝基色氨酸分別合成Acetylaszonalenin和Thaxtomin[38]，NRPSs的底物多樣性有利于非核糖體肽的結構和功能的多樣性。

（2）CDPSs途徑合成環二肽：CDPSs是一類把氨酰-tRNA （aa-tRNA）作為底物的酶，它不需要激活NRPSs途徑中A結構域氨基酸，能夠利用現成的aa-tRNA合成環二肽類化合物。目前已經有較深研究的CDPSs共有三個：Albc、Rv2275、YvmC-Blic，它們的蛋白質晶體結構含有與氨基酸-tRNA合成酶（I型aa-tRSs）類似的Rossmann折疊和CP1[39]，與I型aa-tRSs不同的是CDPSs不存在與ATP結合相關的模體，也沒有明顯的tRNA結合域而是含有大量可與aa-tRNA底物相結合的帶正電的氨基酸序列，結構獨特性允許CDPSs直接利用aa-tRNA作為底物合成環二肽。研究表明，可能的催化機制為：將2分子在核糖體蛋白合成中起重要作用的aa-tRNA作為底物，通過連續的乒乓反應催化合成環二肽[40]。其催化過程大致可分為以下三步：

①CDPSs結合口袋上的Ser的羥基對第一個aa-tRNA進行親核進攻，然后在Tyr和Glu的作用下將氨基酸與CDPSs結合并使tRNA釋放，形成氨酰-CDPSs中間體;

②氨酰-CDPSs結合第二個aa-tRNA，與口袋中的第一個氨基酸縮合形成肽鍵，再次釋放tRNA，形成二肽-CDPSs中間體;

③二肽-CDPSs中間體經分子內催化形成環二肽骨架[41]。形成的環二肽骨架經過與CDPSs相連的后修飾酶的修飾后最終形成結構及功能多樣性的環二肽衍生物。

3 ?結論

作為肽類化合物中最具特征的化合物之一，環二肽類化合物由于其剛性的空間構象，結構多樣性，可用于藥物開發。然而，就目前的情況而言，人類對環二肽的結構、來源、它們的生物學意義及藥理活性的理解并不全面，并且還沒有就藥用價值方面形成相對完整的系統，對此類化合物的研究還處于早期階段，要充分了解它們在自然界中的具體作用并被人們所使用，還有很長的路要走。隨著基因工程、化學酶法和組合生物合成等技術的發展，相信該類化合物很快會在臨床藥學、生物農藥等行業發揮不可取代的作用。

參考文獻：

[1]Stark T， Hofmann T. Structures， sensory aetivity， and dose/response functions of 2，5-diketopiperazines in roasted cocoa nibs （Theobroma cacao）[J]. J Agric. Food Chem.， 2005， 53： 7222-7231.

[2]Fenical W. Chemical studies of marine bacteria： developing a new resource[J]. Chem. Rev.， 1993， 93： 1673-1683.

[3]Zhu H， Sun SW， Li H et al. Significantly improved production of Welan gum by Sphingomonas sp. WG through a novel quorum- sensing-interfering dipeptide cyclo（L-Pro-L-Phe）[J]. Int. J. Biol. Macromol.， 2019， 126： 118-122.

[4]Curtius T， Goebel F. Uber glycollather[J]. J. Prakt. Chem.， 1888， 37（1）：150-181.

[5] Prasad C. Bioactive cyclic dipeptides[J]. Peptides， 1995， 16（1）： 151- 164.

[6]Fischer E. Untersuchungenuberaminosauren， polypeptide und proteine [J]. Ber.， 1906， 39：530-536.

[7]Fischer E， Raske K. Beitragzurstereochemie der 2，5-diketopiperazine[J]. Ber.， 1906， 39： 81-84.

[8]Abderhalden E， Komm E. The formation of diketopiperazines from polypeptides under various conditions[J]. Z. Physiol. Chem.， 1924， 139： 147-152.

[9]Chen YS. Studies on the metabolic products of Roselinianecatrix Berlese [J]. Bull. Agric. Chem， Sot. Jpn.， 1960， 24（4）： 372-381.

[10]Liang WL， Le X， Li H-J et al. Exploring the chemodiversity and biological activities of the secondary metabolites from the marine fungus Neosartoryapseudofischeri[J]. Mar. Drugs， 2014， 12： 5657-5676.

[11]Zin WWM， Buttachon S， Dethoup T et al. New cyclotetrapeptides and a new diketopiperzine derivative from the marine sponge-associated fungus Neosartoryaglabra KUFA 0702[J]. Mar. Drugs， 2016， 14（7）： 136-151.

[12]張弘弛，李慧，安志鵬，等.恒山黃芪內生真菌Aspergillus sp.中環二肽的分離和鑒定[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（12）：52-57.

[13]邱玲，何鑫，馮丹，等.冬蟲夏草中一株內生菌次級代謝產物的化學成分[J].應用與環境生物學報，2018，24（6）：1290-1294.

[14]Yonezawa K， Yamada K， Kouno I. New diketopiperazine derivatives isolated from sea urchin-derived Bacillus sp[J]. Chem. Pharm. Bull.， 2011， 59： 106-108.

[15]Kumar N， Mohandas C， Nambisan B et al. Isolation of proline-based cyclic dipeptides from Bacillus sp. N strain associated with rhabitidentomopathogenic nematode and its antimicrobial properties[J]. World J. Microbiol. Biotechnol.， 2013， 29： 355-364.

[16]何培青，李江，劉彩云，等.北極海洋細菌Pseudoalteromonas sp. 2018抑菌活性及其代謝產物研究[J].海洋科學進展，2018，36（1）：98-107.

[17]Sansinenea E， Salazar F， Jiménez J et al. Diketopiperazines derivatives isolated from Bacillus thuringiensis and Bacillus endophyticus， establishment of their configuration by X-ray and their synthesis[J]. Tetrahedron Lett.， 2016， 57： 2604-2607..

[18]Glessen TW， Marahiel MA. The tRNA-dependent biosynthesis of modified cyclic dipeptides[J]. Int. J. Mol. Sci.， 2014，15： 14610-14631.

[19]Bellezza I， Peirce MJ， Minelli A. Chapter 10 - Cyclic Peptides in Neurological Disorders： The Case of Cyclo（His-Pro）[M]. Council of Italy： Molecular Mechanism and Biotechnological Application， 2019： 257-286.

[20]Minelli A， Grottelli S， Mierla A et al. Cyclo（His-Pro） exerts anti-inflammatory effects by modulating NF-κB and Nrf2 signalling[J]. Int. J.Biochem. Cell Biol.， 2012， 44（3）： 525-535.

[21]Kawamura S， Sakurada S， Sakurada T et al. The antinociceptive effects of histidyl-proline diketopiperazines and thyrotropin- releasing hormone in the mouse[J]. European Journal of Pharmacology， 1985， 112（3）： 287-294.

[22]Ra KS， Suh HJ， Choi JW. Hypoglycemic effects of Cyclo（His-Pro） in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Biotechnol. Bioproc. E， 2012， 17： 176-184.

[23]Song MK， Rosenthal MJ， Song AM et al. Body weight reduction in rats by oral treatment with zinc plus Cyclo（His-Pro）[J]. Brit. J. Pharmacol.， 2009， 158（2）： 442-450.

[24]Lopez LC， Morgan ED. Explanation of bitter taste of venom of ponerine ant， Pachycondylaapicalis[J]. J. Chem. Ecol， 1997， 23（3）： 705-712.

[25]楊子娟，向蘭，邢杰，鄭毅男，等.環二肽的研究進展[J].現代藥物與臨床，2009，24（2）：73-81.

[26]葛亞哲，馬青云，孔凡棟，等.南方靈芝子實體化學成分研究[J].中國中藥雜志，2019，44（3）： 489-494.

[27]Dinsmore CJ， Beshore DC. Recent advances in the synthesis of diketopiperazines[J]. Tetrahedron， 2002， 58： 3297-3312.

[28]Rosenmund P， Kaiser K. Diketopiperazines from Leuchs anhydrides[J]. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.， 1970， 9： 162-163.

[29]Martins MB， Carvalho I. Diketopiperazines： Biological activity and synthesis[J]. Tetrahedron， 2007， 63： 9923-9932.

[30]Santagada V， Fiorino F， Perissutti E et al. A convenient strategy of dimerization by microwave heating and using 2，5-diketopiperazine as scaffold[J]. Tetrahedron Lett.， 2003， 44（6）： 1145-1148.

[31]Mishra AK， Choi J， Choi SJ et al. Cyclodipeptides： An Overview of Their Biosynthesis and Biological Activity[J]. Molecules， 2017， 22（10）： 1796-1809.

[32]Bellezza I， Grottelli S， Mierla AL et al. Neuroinflammation and endoplasmic reticulum stress are coregulated by cyclo（His-Pro） to prevent LPS neurotoxicity[J]. Int. J. Biochem. Cell Biol.， 2014， 51： 159-169.

[33]Schwarzer D， Finking R， Marahiel MA. Nonribosomal peptides： From genes to products[J]. Nat. Prod. Rep.， 2003， 20： 275–287.

[34]薛永常，張成鎖，李根.非核糖體肽合成酶基因腺苷酰化結構域序列克隆及分析[J].微生物學雜志，2019，39（1）： 20-25.

[35]薛永常，李根.非核糖體肽合成酶裝配機制研究進展[J].生命的化學，2018，38（3）：409-414.

[36]Lazos O， Tosin M， Slusarczyk AL et al. Biosynthesis of the putative siderophoreerythrochelin requires unprecedented crosstalk between separate nonribosomal peptide gene clusters[J]. Chem. Biol.， 2010， 17（2）： 160-173.

[37]Schultz AW， Oh DC， Carney JR et al. Biosynthesis and structures of cyclomarins and cyclomarazines， prenylated cyclic peptides of marine actinobacterial origin[J]. J. Am. Chem. Soc.， 2008， 130（13）： 4507-4516.

[38]李文利，夏娟.二酮哌嗪類化合物生物合成研究進展[J].微生物學通報，2014，41（1）：111?121.

[39]張京星，姚婷婷，劉晶，等.環二肽合酶生物合成途徑研究進展[J].有機化學，2019，39：328-338.

[40]Canu N， Belin P， Thai R et al. Incorporation of Non-canonical Amino Acids into 2，5-Diketopiperazines by Cyclodipeptide Synthases[J]. Angew. Chem. Int. Ed.， 2018， 57： 3118–3122.

[41]Gondry M， Jacques IB， Thai R et al. A Comprehensive Overview of the Cyclodipeptide Synthase Family Enriched with the Characterization of 32 New Enzymes[J]. Front. Microbiol.， 2018， 9： 46-60.