響應面法優選黃芩苷水提工藝

翟陽 趙渤年

摘 ? ? ?要：為了優選黃芩藥材中黃芩苷的最佳水提工藝，在單因素實驗的基礎上，采用了響應面分析法，以黃芩苷含量為評價指標，優選黃芩藥材中黃芩苷的水提工藝參數。結果最佳水提工藝參數為提取時間2.25 h，料液比57 mL/g，提取次數2次。優選的工藝合理可行，提取效率高，可作為黃芩中黃芩苷的水提工藝，更適合于臨床實際需求。

關 ?鍵 ?詞：黃芩苷;響應面法;水提工藝;含量測定

中圖分類號：R284.2 ? ? ? 文獻標識碼： A ? ? ?文章編號： 1671-0460（2020）02-0349-04

Abstract： To optimize the extraction process of baicalin from scutellariabaicalensis， on the basis of single factor experiment， the response surface analysis was used to optimize the extraction parameters of baicalin from scutellariabaicalensis with the baicalin content as the evaluation index. The optimum water extraction process parameters were determined as follows： the extraction time 2.25 h， material-to-liquid ratio 57 mL/g， and extraction times 2 times. The optimized process is reasonable and feasible. It can be used for the water extraction process of baicalin from scutellariabaicalensis and it is more suitable for clinical practice.

Key words： Baicalin; Response surface method; Water extraction technology; Content determination

中藥黃芩最早記載于《神農本草經》，屬于唇形科植物，呈性寒，味苦，有清熱、瀉火、止血之功效，黃酮類和多糖類以及揮發油等是黃芩的主要化學成分[1]，其中黃芩苷為黃芩主要有效成分，藥理作用廣泛，主要包括抑菌作用、抗腫瘤作用、抗動脈粥樣硬化、抗氧化作用、抗炎作用、抗病毒作用等[2-7]。

目前黃芩苷提取工藝主要有電磁裂解提取、超聲提取、微波提取、乙醇回流提取等方式，但相比而言水提法成本低、安全性高，普遍性廣、實用性好，且與傳統中醫用藥方法相契合[8-10]。

提取工藝的參數優化通過響應面法和正交設計法均可實現，但是響應面法能夠以圖形的形式將自變量與因變量之間的函數關系表現出來，具有數據直觀明確、更易于發現最佳工藝、成本較低等優點，因此本實驗采取響應面法優化黃芩藥材中黃芩苷的水提工藝[11]。

1 ?實驗部分

1.1 ?儀器

FW-80高速萬能粉碎機（北京市光明醫療儀器有限公司）;Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）;BP211D型電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）;VS-1300-U 型潔凈工作臺（蘇州安泰工空技術有限公司）;Molgene 1820D摩爾基因型純水機（上海摩勒科學儀器有限公司公司）;德國默克密理博Milli-Q IQ 7000超純水系統（南京科麟得科學儀器有限公司）;Venusil MP C18（4.6 mm × 250 mm，5μm）;KDM-A控溫電熱套（金壇市醫療儀器廠）。

1.2 ?試劑

磷酸（天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純）;甲醇（上海星可高純溶劑有限公司，色譜純）;高效液相色譜用水為超純水。

1.3 ?試藥

黃芩藥材購自同仁堂（批號：20180712，產地：內蒙，經山東省中醫藥研究院林慧彬研究院鑒定為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根），經含量測定質量合格[12];黃芩苷（批號：110715-200815，中國藥品生物制品鑒定所）。

2 ?方法與結果

2.1 ?黃芩苷的含量測定

2.1.1 ?色譜條件

色譜柱：Venusil MP C18（4.6 mm × 250 mm，5μm）;以甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）為流動相;檢測波長為280 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量10 ?L。理論塔板按黃芩苷峰計算應不低于2 500[12]。

2.1.2 ?樣品溶液的制備

（1）對照品溶液的制備 ?精密稱取黃芩苷對照品0.6 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中。

（2）供試品溶液的制備 ?取干燥黃芩藥材，粉碎至中粉，精密稱定0.5 g，按照試驗條件加入一定比例的水，回流提取，放冷，濾過，濾液置于100 mL容量瓶中，用少量水粉刺洗滌容器和殘渣，洗液濾入同一量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置于10 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 ?線性關系考察

精密吸取2、4、6、8、10、20 μL的對照品溶液依次注入液相色譜儀，測定，得回歸方程：y =133 691x-2 507.4，r2 =0.999 7結果表明，黃芩苷在0.12～1. 20 ?g范圍內線性關系良好。

2.1.4 ?精密度試驗

精密吸取10μL的黃芩苷對照品溶液，接連進樣6次，測定，RSD值為1.11%，證明儀器精密度良好。

2.1.5 ?重復性試驗

精密稱定黃芩中粉0.5 g，平行6份，制備供試品溶液，測定，RSD值為1.79%，證明該方法重復性良好。

2.1.6 ?穩定性試驗

取一定量供試品溶液分別在第0，2，4，8，12，24 h注入液相色譜儀，測定，結果黃芩苷峰面積值RSD值為0.69%，證明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.7 ?加樣回收試驗

精密稱定黃芩中粉0.5 g，平行5份，回流提起，分別精密移取提取液1 mL（黃芩苷0.085 5 mg/mL）分別精密加入黃芩苷對照品溶液1 mL（黃芩苷0.085 mg/mL），制備供試品溶液，測定，計算得平均回收率為97.23%，RSD為2.17%。

2.2 ?水提工藝的響應面法優選

2.2.1 ?響應面數據分析

（1）設計方案及試驗結果在單因素實驗基礎上，根據Box-Behnken設計的中心組合實驗設計原理，以提取時間（A， h）、料液比（B， mL/g）、提取次數（C， 次）為黃芩苷水提工藝中的自變量，進行三因素三水平的實驗設計，以黃芩苷的提取率為因變量，進行分析。設計方案及實驗結果見表1，其中1、2、9、10、12為中心試驗，3、4、5、6、7、8、11、13、14、15、16、17為析因實驗。

提取時間（A， h）、料液比（B， mL/g）、提取次數（C， 次）三個因素經二次多項式回歸擬合后，得到提取率（Y）對三因素的二次多項回歸方程為：

Y=16.97+0.20A+0.31B+0.20C-0.35AB-0.34AC+0.28BC-0.78A2-0.33B2-1.26C2

（2）模型建立及顯著性分析采用 Design- Expert 8.0.6 對表2 中的數據進行回歸擬合，得到黃芩苷提取參數回歸分析結果，如表2所示。

由表2黃芩苷參數回歸分析可知，擬合模型P=0.045 1<0.05，說明回歸模型已達顯著程度，失擬度P=0.675 3>0.05，表明未知因素對該試驗影響較小，殘差均有隨機誤差引起。該模型的相關系數R2=0.912 3，說明該模型擬合程度較好，實驗誤差小。從F值來看，在所選因素范圍內，料液比對黃芩苷提取率影響最大，提取時間、提取次數影響較小。交互項AB、AC、BC，P值均大于0.05，說明對黃芩苷提取率影響不顯著。二次項A2對提取率影響顯著（P<0.05），二次項C2對提取率影響極顯著（P<0.01），說明了各種水提工藝與黃芩苷提取率之間并不是簡單的線性關系，而是一種非線性關系。綜上所述，該模型擬合度較高，可用該模型描述各工藝與黃芩苷提取率之間的關系，可用該模型來合理推測黃芩藥材中黃芩苷的最佳水提工藝。

2.2.2 ?響應面結果及分析

通過響應面3D圖能直觀地看出各因素對提取率的影響，其中料液比對黃芩苷的提取率影響加大，提取時間與提取次數影響較小，從交互作用來看，料液比與提取次數的交互作用最為明顯，其次是提取次數與提取時間，最后是料液比與提取時間。通過對回歸模型求解方程，得出黃芩苷最佳水提工藝條件為：提取時間2.25 h，料液比56.52 mL/g，提取次數2.12次。此條件下黃芩苷的理論提取率為17.103 7%（圖1-6）。

2.2.3 ?驗證試驗

為了檢驗實驗模型真實性、可靠性、可行性，進行以下驗證試驗：精密稱定同一批次0.5 g黃芩中粉，平行三次，按照 “2.1.2.2”項下操作，黃芩苷提取率為16.97%，RSD值1.27%，與預測誤差僅為0.133 7%，證明通過響應面法優化的黃芩苷水提工藝合理可靠。

3 ?討論

目前黃芩苷提取工藝種類豐富，如：電磁裂解提取工藝、超聲提取法、微波提取法等。這些提取方法雖然省時環保，但對儀器設備要求較高，并不符合實際生產生活需求。傳統中藥提取物多采用口服給藥的方式，但黃芩苷的提取多用各種溶度的乙醇作為溶媒[13-15]，無法直接給藥和用于藥理學實驗研究。水煎法是傳統中藥提取方法，適用范圍廣，安全系數高，操作簡便，經濟成本低，更加適用于臨床實際需求。

目前優化黃芩苷的水提工藝多采用正交設計法[16-18]，響應面法鮮有報道，本次試驗以黃芩苷的提取率為衡量指標，在單因素的實驗基礎上，利用響應面法對水提工藝中的提取時間、料液比、提取次數三個因素進行分析研究，優選最佳提取工藝。得出黃芩藥材中黃芩苷的最佳水提工藝為：提取時間2.25 h，料液比56.52 mL/g，提取次數2.12次，此條件下，黃芩苷的提取率為17.103 7%，考慮到實際操作條件將工藝條件調整為提取時間2.25 h，料液比57 mL/g，提取次數2次。

參考文獻：

[1]羅燕子.中藥黃芩的化學成分及藥理作用的相關研究進展[J].臨床合理用藥雜志，2018，11（30）：180-181.

[2]肖紅俠，張喜霞，邵世峰，等.黃芩苷對結核分枝桿菌抑菌作用的研究[J].臨床檢驗雜志，2017，35（04）：291-292.

[3]王婷婷，趙鵬翔，謝飛.黃芩苷的抗腫瘤作用及機制研究進展[J].生物技術進展，2019，9（01）：13-20.

[4]肖意川，張許，柯培雄，等.黃芩苷在心血管疾病中的藥理作用研究新進展[J].廣東醫學，2018，39（24）：3587-3590.

[5]吳宜艷，韓楊，李玲玉，等.黃芩苷通過抗氧化對H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用[J].中國醫藥導報，2018，15（27）：8-11.

[6]王廣志，姜楠，賽鳳英，等.黃芩苷對膠原誘導性關節炎大鼠抗炎作用研究[J].中國藥物與臨床，2017，17（04）：498-501.

[7]詹鈾超，秦笙，陳富.黃芩苷抗呼吸道合胞病作用的研究[J].國際檢驗醫學雜志，2017，38（14）：1907-1909.

[8]王仁廣，賈艾玲，邱智東，等.響應面法優化黃芩中黃芩苷的電磁裂解提取工藝[J/OL].中國實驗方劑學雜志：1-7[2019-03-30].https： //doi.org/10.13422/j.cnki.syfjx.20191349.

[9]劉昊，常仁旭，陳博，等.正交試驗優化黃芩中黃芩苷超聲提取工藝[J].黑龍江畜牧獸醫，2017（22）：162-164.

[10]邵紅，劉昊，趙自冰，等.正交設計法優化黃芩苷微波提取工藝[J].湖南農業科學，2017（09）：92-94.

[11]楊靜，王茜，韓紅娟，等.樹莓黃酮提取工藝的響應面法和正交法比較[J].食品研究與開發，2015，36（18）：101-105.

[12]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京：化學工業出版社，2015，301.

[13]雷燕妮，張小斌.中藥黃芩苷的提取工藝研究[J].陜西農業科學，2012，58（06）：121-124.

[14]楊明，陶蕾，王文，等.黃芩中黃芩苷的正交提取工藝及體外抑菌活性研究[J].中獸醫醫藥雜志，2011，30（03）：43-45.

[15]沙子健，付雙，許鳳.中藥黃芩中黃芩苷的提取工藝研究[J].齊齊哈爾醫學院學報，2010，31（12）：1928.

[16]王聰，唐雪梅，周健，等.黃芩苷的提取工藝及高效液相含量測定[J].現代中藥研究與實踐，2012，26（03）：53-56.

[17]劉璐，楊麗杰，李希娜，等.正交設計法優選黃芩苷提取工藝[J].中華中醫藥學刊，2010，28（07）：1437-1438.

[18]郭銀周，卜秀芹.黃芩中黃芩苷的提取工藝研究[J].中國傷殘醫學，2013，21（09）：92-94.