不同彈性蛋白酶酶活力條件下野生與養殖全蝎活性成分含量及體外抗腫瘤實驗的對比研究

毛會秀 陳美琦 陶然

摘 ? ? ?要：研究了彈性蛋白酶酶活力對野生與養殖全蝎活性成分含量及體外抑制腫瘤細胞生長的影響，篩選了彈性蛋白酶的最佳用量。依據全蝎混合酶解工藝中最佳提取條件，在彈性蛋白酶酶活力分別為2 000、1 000、400、200、20和0 U的條件下，分別測定野生與養殖全蝎中蛋白質和糖胺聚糖的含量及對肺腺癌（A549）細胞的抑制率。結果養殖全蝎的蛋白質含量顯著高于野生的，而糖胺聚糖含量則顯著低于野生的;養殖全蝎對肺腺癌細胞的抑制效果高于野生全蝎的抑制效果，且當彈性蛋白酶的酶活力為200 U時，養殖全蝎對A549細胞的抑制效果最佳，IC50值為0.331 mg/mL。養殖全蝎對肺腺癌細胞具有較高的抑制作用，彈性蛋白酶的最優酶活力為200 U。

關 ?鍵 ?詞：野生全蝎;養殖全蝎;糖胺聚糖;蛋白質;抑制率

中圖分類號：R979.1 ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ?文章編號：1671-0460（2020）02-0328-04

Abstract： To study the effect of different elastase activities on the active components and the inhibition of tumor cell growth in vitro of wild scorpions and cultured scorpions， the optimum use level of elastase was screened out. According to the optimum enzymatic hydrolysis conditions of scorpion， under the condition of 2 000， 1 000， 400， 200， 20 and 0 U of enzyme activity units， the contents of protein and glycosaminoglycan in wild scorpions and cultured scorpions were determined as well as the inhibition rates of lung adenocarcinoma （A549） cell. The results showed that the protein content of cultured scorpion was higher than that of the wild scorpion， but the content of glycosaminoglycan of cultured scorpion was lower than that of the wild scorpion. The inhibitory effect of cultured scorpion on lung adenocarcinoma cells was higher than the wild scorpion. Moreover， when the enzyme activity of elastase was 200 U， the inhibitory effect of cultured scorpion on A549 cells was the best， and the IC50 value was 0.331 mg/mL. Cultured scorpion had higher inhibitory effect on lung adenocarcinoma cells， and the optimal enzyme activity units of elastase was 200 U.

Key words： Wild scorpion; Cultured scorpion; Glycosaminoglycan;Protein; Inhibition rate

全蝎具有通絡止痛、攻毒散結等功效[1];半仿生-酶法是將半仿生提取法與生物酶結合起來的一種新的有效物質提取方法。首先對中藥進行預處理，破壞其細胞結構，加快有效成分的充分溶出，加速提取進程[2]，然后通過仿照人體腸道酸堿度、各種酶的種類以及酶解時間等條件，對樣品進行體外酶解處理，從而獲得小分子的、具有更高生物活性的肽類物質。近年來，全蝎單味藥、全蝎復方藥被廣泛地應用于臨床中，具有鎮痛、鎮靜、抗腫瘤[3]、抗炎以及提高機體免疫[4]等藥理作用，極具開發價值。隨著全蝎的開發，市場對其的需求量越來越大，為滿足市場的需要和實現全蝎藥材供應的持續穩定，全蝎養殖正在逐漸興起，大有逐步取代野生全蝎供應的趨勢。但養殖全蝎能否完全替代野生全蝎仍需從各有效成分含量及藥理活性等方面進行系統考查。桑曉[5，6]等通過采用HPLC法對比研究了野生全蝎與養殖全蝎中游離?；撬岬暮考盎旌厦附夂笠吧c養殖全蝎對肺腺癌細胞的抑制效果，結果表明養殖全蝎的牛磺酸含量和對肺腺癌細胞的抑制效果均高于野生全蝎。焦方文[7]等采用酶解法對全蝎進行單個酶篩選，得出胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶對A549細胞的抑制率均高于不加酶的全蝎水提液，并進行了全蝎混合酶解工藝的優化。因此，本項目采用混合酶解法，測定不同酶活力下野生與養殖全蝎的活性成分含量的變化，并以不同環境下的全蝎對A549細胞的抑制率為指標，優化酶解工藝中彈性蛋白酶的酶活力。

1 ?實驗部分

1.1 藥材

全蝎購自臨沂沂水，經山東中醫藥大學高德民副教授鑒定為正品。

1.2 試劑

牛血清蛋白（上海伯奧生物科技有限公司）;彈性蛋白酶等（上海源葉生物科技有限公司）;阿利新藍（上海麥克林生化科技有限公司）;Hyclone-1640細胞培養基（賽默飛世爾生物制品北京有限公司）;濃硫酸、硫酸銅等均為分析純。

1.3 儀器

UV9100B可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）;DNM-9602酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司）。

1.4 細胞株

肺腺癌細胞由山東省立醫院提供。

2 ?實驗方法

2.1 ?全蝎粉的制備

將購買的全蝎凈選，優選出成年蝎，洗凈，于凍干機中冷凍，打磨勻漿，冷凍干燥，得全蝎粉。

2.2 ?全蝎酶解液的制備

精密稱取1.000 0 g全蝎粉置于50 mL具塞錐形瓶，按1∶40料液比加入蒸餾水，超聲30 min，pH調至8.5，加入2 000 U的胰凝乳蛋白酶和2 000 U的胰蛋白酶，彈性蛋白酶的量分別為2 000、1 000、400、200、20和0 U，于40 ℃水浴鍋中保溫3 h，每隔1 h調1次pH值，離心，抽濾，得全蝎酶解液，將酶解液一部分用于含量測定，另一部分用于冷凍干燥得凍干粉。

2.3 ?蛋白質和糖胺聚糖的含量測定

采用改良Lorry法[8]測定蛋白質含量，得標準曲線為Y=0.002 2X+0.006 6。取“2.2”項中的全蝎酶解液，稀釋到一定體積，于650 nm波長處測定不同酶活力條件下蛋白質的吸光度，按照標準曲線計算不同酶活力的全蝎蛋白質含量。

采用阿利新藍[6]染色法測定糖胺聚糖含量，得標準曲線為Y=0.633 4X-0.006 4。取“2.2”項中的全蝎酶解液，稀釋到一定量的濃度，于490 nm波長處測定不同酶活力條件下糖胺聚糖的吸光度，按照標準曲線計算不同酶活力的全蝎糖胺聚糖含量。

2.4 ?體外抗腫瘤實驗研究

2.4.1 ?溶液配制

稱取一定量的不同酶活力的全蝎凍干粉，在無菌條件下，加入一定體積的 1640培養基，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，然后用1640培養基逐步稀釋，配成0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL藥物濃度。

2.4.2 ?MTT法檢測

將處于對數生長期的肺腺癌A549細胞用胰酶進行消化，加入1640培養液制成細胞濃度為1×106 mL的細胞懸液，然后以每孔100μL接種到96孔板上，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，24 h后，棄去上清液，每孔加入配好的藥物濃度100 μL，每個濃度重復5個孔，陰性對照組加入不含血清的1640培養基100 μL，陽性對照組加入100 μL 100 μg/mL的順鉑溶液，放入培養箱中培養，24 h后，避光，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，放入培養箱中繼續培養4 h ，吸去上清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，搖勻，于492 nm波長處測定OD值，并計算不同藥物濃度對A549的抑制率。

3 ?統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析，用方差分析確定實驗之間的差異性及統計學意義，實驗數據以xs表示。

4 ?實驗結果

4.1 ?不同酶活力的野生與養殖全蝎蛋白質和糖胺聚糖含量的對比

由表1可得，養殖全蝎蛋白質含量均高于野生全蝎的蛋白質含量，除酶活力為1 000 U外，其余酶活力的p值均小于0.01，說明兩者的蛋白質含量存在極顯著性差異。

由表2可得，養殖全蝎的糖胺聚糖含量明顯低于野生全蝎的含量，且兩者的p值均小于0.01，說明野生全蝎與養殖全蝎的糖胺聚糖含量存在極顯著性差異。

4.2 ?不同彈性蛋白酶酶活力的野生與養殖全蝎對肺腺癌細胞抑制率的影響

由表3實驗結果可得，不同藥物濃度對A549的抑制效果大體上呈上升態勢，當彈性蛋白酶的酶活力分別為2 000、1 000、400、200、20和0 U時，其IC50值分別為0.727、0.485、0.433、0.331、0.457和0.641 mg/mL，由此可得，當彈性蛋白酶的酶活力為200 U時，全蝎混合酶解工藝對A549的抑制效果最佳。

表4實驗數據均為當藥物濃度為1 mg/mL時，不同彈性蛋白酶酶活力的野生全蝎對A549的抑制率。當藥物濃度低于1 mg/mL時，藥物對A549的抑制作用極弱，且在設定的濃度范圍內，1 mg/mL的藥物濃度對A549的抑制率最高。

5 ?結論

在以前的研究中，野生全蝎酶解的彈性蛋白酶最佳用量為2 000 U[9]，由于彈性蛋白酶的市場價非常高，實驗中所使用的彈性蛋白酶的成本占到了整個酶解提取物總成本的80%;本研究成果在明確了同等條件下養殖全蝎抑制肺腺癌細胞株的效果優于野生全蝎的基礎上，又進一步探討了不同彈性蛋白酶用量對體外肺腺癌細胞株的影響，并進而明確了最佳的彈性蛋白酶的用量為200 U，從而使彈性蛋白酶的用量減少了80%，使整個產品成本也降低了大約80%，具有極大的經濟效益。

蛋白酶解過程不僅可以將大分子多肽酶解為小分子肽、寡肽及氨基酸，還會將一些本來在水中難溶的蛋白質變為可溶，因此不同的酶用量會得到不同的蛋白質含量，但糖胺聚糖不受此影響。養殖全蝎與野生全蝎之間在蛋白質和糖胺聚糖之間的差異多是由其生長的環境條件決定的，與酶解的條件無關。經研究發現養殖全蝎中的蛋白質含量較野生全蝎豐富，而糖胺聚糖含量則野生全蝎中較多，養殖全蝎對A549細胞株的抑制率遠高于野生全蝎，可能是因為養殖全蝎營養較有保證造成的。當養殖全蝎的彈性蛋白酶酶活力為200 U時，其對A549細胞的抑制效果最佳。本文主要從野生全蝎與養殖全蝎的活性成分含量及抗腫瘤效果的對比研究中，優化了全蝎酶解工藝中彈性蛋白酶的用量，降低了成本，并為養殖全蝎完全替代野生全蝎用于臨床提供了實驗基礎。

參考文獻：

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