輻照培養基適用性改善及Bacillus firmus GL3產過氧化氫酶對其適用性的影響

徐玲，寧喜斌,2,3,4*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306)3(農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)，上海，201306)4(國家淡水水產品加工技術研發分中心(上海)，上海，201306)

隨著新版藥品生產質量管理規范(good manufacturing practices，GMP)的深入落實，更加標準化的預罐裝培養平皿被應用于潔凈環境的微生物監測。無菌預罐裝培養平皿是經鈷60輻照終端滅菌的培養基[1]。一定劑量的輻照可以確保無菌但會引起其他物質的物理和化學變化，抑制某些類群微生物的生長[2-5]。為確保監測結果的準確性，必須要對輻照培養基進行適用性檢查并提高輻照培養基的適用性。前人研究指出[6-8]，金屬離子或某些還原性較強的化合物對過氧化物有不同的影響。1991年，MARTHI等[9]首次報道了氨基酸的抗氧化作用，發現氨基酸的抗氧化活性很高。另外，微生物來源的過氧化氫酶由于其高活性、快速繁殖、易于處理并且可作為解毒系統，抵抗不同氧化反應形成的活性氧[10-12]。因此尋找改善輻照培養基的添加劑和研究添加劑的作用，具有一定的現實意義。

實驗采用標準菌株金黃色葡萄球ATCC 6538、枯草芽孢桿菌ATCC 6633、銅綠假單胞菌ATCC 9023、白色念珠菌ATCC 10231、黑曲霉ATCC 16404、人參土芽孢桿菌對胰酪大豆胨瓊脂(tryptic soy agar，TSA)輻照培養基進行質量評價[13]。同時，通過延長輻照培養基貯存時間以及向輻照培養基中添加某些無菌還原性化合物(過氧化氫酶、五倍子酸、抗壞血酸、硫胺素、焦性沒食子酸)、氨基酸(主要是L-半胱氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、丙氨酸、酪氨酸)、金屬離子(Mg2+、Cu2+、K+、Mn2+、Zn2+、Fe3+)、產過氧化氫酶菌株(C3、H1、GL3、H5、1-5、1-10、2-4、2-9)的無菌發酵液等，觀察各因素對輻照培養基中微生物恢復生長有何種直接影響，來反映各因素對輻照培養基適用性的改善效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種與試劑

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 6538、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC 6633、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 9023、白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC 10231、黑曲霉(Aspergissusniger)ATCC 16404、人參土芽孢桿菌(Bacillusginsengihumi)，由上海諾狄生物科技有限公司及本實驗室提供；菌株C3、H1、GL3、H5、1-5、1-10、2-4、2-9，分別篩選自上海東海海水及藥廠潔凈環境，其中GL3是具有高過氧化氫酶活性的菌株，經生理生化鑒定后命名為BacillusfirmusGL3(B.firmusGL3)。以上菌株均由本實驗室保存在-80℃冰箱。

實驗所用化學試劑均為分析純，國藥化學試劑有限公司。

1.1.2 培養基

胰酪大豆胨瓊脂(TSA)培養基，分為輻照終端滅菌與對照培養基2種。

種子培養基，胰酪大豆胨液體(TSB)培養基和2216E液體培養基(用于海生細菌培養)，121 ℃滅菌15 min。

發酵培養基同種子培養基。

1.1.3 儀器與設備

紫外可見分光光度計UV-VIS 2 300，上海天美科學儀器有限公司； 臺式pH730精密測試儀，德國WTW；ClassⅡBSC生物安全柜，ESCO公司；高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 輻照培養基適用性檢查

按照《中國藥典》2015年版四部“1106非無菌產品微生物限度檢查。微生物計數法”的規定[14-16]培養基的適用性以菌落回收率和菌落形態作為判定標準。潔凈環境監測用的TSA培養基經輻照終端滅菌后產生自由基的氧化反應，因此要對輻照TSA培養基進行適用性檢查。

菌液制備：將5種標準菌株和人參土芽孢桿菌的新鮮培養物，用0.9%的無菌生理鹽水稀釋成不大于100 CFU/mL的菌懸液。取各供試菌的菌懸液0.1 mL分別涂布于對照TSA培養基、輻照TSA培養基上，置于30～35℃的恒溫培養箱中培養72 h，每個TSA培養基上的供試菌都要有3次平行實驗，最后進行菌落計數并觀察菌落形態及菌落分布均勻情況如公式(1)所示。

(1)

1.2.2 影響輻照培養基適用性的因素

主要考察輻照培養基貯存時間以及輻照培養基中添加某些輔助添加劑對輻照培養基適用性的影響，添加劑都經過0.25 μm的細菌過濾器過濾除菌。實驗以敏感菌株金黃色葡萄球菌ATCC 6538和人參土芽孢桿菌為供試菌，菌液制備同1.2.1所述。

1.2.2.1 培養基貯存時間對輻照培養基適用性的影響

取供試菌的菌懸液0.1 mL分別涂布于經鈷60輻照滅菌后貯存0、5、10、15、20、25 d的TSA培養基上，置于37 ℃恒溫培養箱中培養48 h，進行菌落計數。

1.2.2.2 還原性化合物對輻照培養基適用性的影響

取供試菌的菌懸液0.1 mL分別涂布于添加有10 μL 0.1 mol/L的無菌還原性化合物硫脲、五倍子酸、抗壞血酸、硫胺素、焦性沒食子酸的輻照TSA培養基上，置于37 ℃的恒溫培養箱中培養48 h，進行菌落計數。

1.2.2.3 氨基酸對微生物生長的影響

取供試菌的菌懸液0.1 mL分別涂布于添加10 μL 0.1 mol/L的氨基酸L-半胱氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的輻照TSA培養基上，置于37 ℃的恒溫培養箱中培養48 h，進行菌落計數。

1.2.2.4 金屬離子對微生物生長的影響

取供試菌的菌懸液0.1 mL分別涂布于添加10 μL 0.1 mol/L的金屬離子Mg2+、Cu2+、K+、Mn2+、Zn2+、Fe3+的輻照TSA培養基上，置于37 ℃的恒溫培養箱中培養48 h，進行菌落計數。

1.2.2.5 粗酶發酵液對微生物生長的影響

將菌株C3、H1、GL3、H5、1-5、1-10、2-4、2-9的發酵液在10 000 r/min的條件下離心10 min，并將上清液通過0.25 μm的細菌過濾器以除去細菌。取供試菌的菌懸液0.1 mL分別涂布于添加10 μL 0.1 mol/L的無菌粗酶發酵液的輻照TSA培養基上，置于37 ℃的恒溫培養箱中培養48 h，進行菌落計數。

1.2.3 菌株GL3產過氧化氫酶條件的優化及應用

菌株GL3是前期通過生理生化鑒定的1株高過氧化氫酶活性菌株。在單因素的基礎上，通過pLackett- burman(PB)實驗篩選出顯著影響因素并利用中心復合設計(box-benhnken design, BBD)優化顯著因素的響應面實驗，以期獲得更高過氧化氫酶活性為改善培養基的適用性奠定基礎。

1.2.3.1 過氧化氫酶活性的測定

采用分光光度法測定無菌體發酵液的酶活性[17-18]。以過氧化氫在240 nm處的分解速率計算酶活性。反應體系為pH=7，50 mmol/L的磷酸緩沖液，H2O2濃度30 mmol/L。取40 μL粗酶液加入2 mL磷酸緩沖液中，在比色杯中混勻，在迅速加入以磷酸緩沖液配制的30 mmol/L的H2O21 mL起始反應，反應總體積為3.04 mL。酶活性單位(1U)定義為25 ℃每分鐘降解1 μmol H2O2(1 μmol/min)。酶活性計算如公式(2)：

(2)

式中：ΔA，240 nm下的吸光度變化值；Δt，反應時間，min；D，粗酶的稀釋倍數；Vm，反應總體積，mL；M，1 μmol/mL過氧化氫在 240 nm處的吸光度，其值為0.043 6；V0，稀釋的粗酶體積，mL；酶活性，U/mL。

1.2.3.2 顯著因素篩選實驗

由于NaCl(g/L)、pH、時間(h)、溫度(℃)、H2O2(%)、接種量(%)、Mg2+(g/L)和裝液量(mL)都會影響菌株GL3產過氧化氫酶的活性。因此通過PB實驗對上述8因素進行顯著因素的篩選。

1.2.3.3 響應面優化實驗

對篩選的顯著因素采用Box-Benhnken實驗設計，進行菌株GL3產過氧化氫酶活性的條件優化，最后在優化條件下得到GL3產過氧化氫酶的最優酶活性。

1.2.3.4B.firmusGL3優化后發酵液的應用

向輻照TSA培養基分別添加10 μL 0.1 mol/L的過氧化氫酶、未優化的GL3無菌粗酶發酵液以及優化后的GL3無菌粗酶發酵液，最后每個TSA培養基分別接種0.1 mL供試菌的菌懸液，并置于37 ℃的恒溫培養箱中培養48 h，進行菌落計數。

2 結果與分析

2.1 輻照培養基適用性檢查

《中國藥典》規定被檢培養基菌落數與對照培養基菌落數比值應在0.5～2，且菌落形態大小應與對照培養基上的菌落一致[19]。通過各種供試菌在對照培養基與輻照培養基上菌落回收數率的比較可知(表1)，輻照培養基中供試菌金黃色葡萄球菌ATCC 6 538和人參土芽孢桿菌的菌落回收率低于50%，且菌落分布較均勻；而其余供試菌的菌落回收率正常，菌落分布均勻。表明輻照后培養基發生自由基的氧化反應，產生某種物質抑制金黃色葡萄球菌和人參土芽孢桿菌的正常生長。

表1 TSA輻照培養基適用性檢查結果Table 1 The suitability test results of TSA irradiation medium

2.2 不同因素對輻照培養基適用性的影響

2.2.1 貯存時間對輻照培養基適用性的影響

比較了輻照終端滅菌的培養基貯存時間對其適用性的影響，結果如圖1所示。圖1結果顯示輻照培養基貯存期在0～15 d，2種供試菌的生長仍然受到抑制；當貯存時間超過15 d后，2種供試菌的生長恢復正常。此研究結果表明輻照對敏感菌的抑制作用能夠隨培養基貯存時間的延長而消失。對于輻照的TSA培養基貯存15 d后可以正常使用。

圖1 貯存時間對輻照培養基適用性的影響Fig.1 The effect of storage time on the suitability of irradiation medium

2.2.2 有機化合物對輻照培養基適用性的影響

比較了不同化合物對輻照培養基適用性的影響，結果如圖2所示。考慮到輻照產生自由基的氧化反應，在輻照培養基中添加各種具有還原性的化合物后，金黃色葡萄球菌與人參土芽孢桿菌的菌落生長有所恢復，其中焦性沒食子酸與五倍子酸對輻照培養基中菌株恢復生長的效果比硫胺素、硫脲、抗壞血酸的恢復效果好，但是2種菌菌落總數還是低于對照培養基中的菌落總數。

圖2 還原性化合物對輻照培養基適用性的影響Fig.2 The effect of reducing compounds on thesuitability of irradiation medium

2.2.3 氨基酸對輻照培養基適用性的影響

比較了不同氨基酸對輻照培養基適用性的影響，結果如圖3所示。輻照產生自由基的氧化反應，輻照培養基中不同外源氨基酸的添加對自由基的清楚能力不同。輻照培養基中添加蛋氨酸、丙氨酸、絲氨酸后，對金黃色葡萄球菌ATCC 6538和人參土芽孢桿菌的生長有抑制作用；而L-半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的添加能夠促進2種供試菌在輻照培養基的生長。實驗表明L-半胱氨酸、酪氨酸對輻照產生的自由基清除能力最強，苯丙氨酸次之；蛋氨酸、丙氨酸、絲氨酸無自由基的清楚能力。此研究結果與李新、許猛的研究結果一致[20-21]。

圖3 氨基酸對輻照培養基適用性的影響Fig.3 The effect of amino acids on the applicability of irradiated medium

2.2.4 金屬離子對輻照培養基適用性的影響

比較了不同金屬離子對輻照培養基適用性的影響，結果如圖4-a所示。多種金屬離子的添加對輻照培養基中微生物的生長具有直接的影響，Mg2+、Mn2+、K+的添加對輻照培養基中微生物的生長具有一定的促進作用，而培養基中Cu2+、Fe3+的添加對微生物生長具有抑制作用，Zn2+對輻照培養基適用性的影響不大。此研究結果與RICCIARDI等和JUNILLON等的研究結果一致[22-23]。同時比較了不同金屬離子對金黃色葡萄球菌和人參土芽孢桿菌的過氧化氫酶活性的影響(圖4-b)，通過研究發現Mg2+、Mn2+、K+的添加可以促進2種菌過氧化氫酶的產生，而Cu2+、Fe3+的添加對菌株的過氧化氫酶活性有抑制作用。以上研究結果表明，輻照產生自由基的氧化反應主要生成過氧化氫，2種供試菌對輻照產生的過氧化氫敏感，特別是人參土芽孢桿菌；另外，菌株過氧化氫酶活性的提高可以抵消過氧化氫對敏感菌株的脅迫作用。

a-菌落總數；b-相對酶活性圖4 金屬離子對輻照培養基適用性及供試菌酶活性的影響Fig.4 The applicability of metal ions to irradiation medium and the activity of enzymes for test bacteria

2.2.5 篩選菌株的粗酶發酵液對輻照培養基適用性的影響

輻照培養產生自由基氧化反應形成過氧化氫，它可以被過氧化氫酶利用。FREY等和STRUHARNANSKA等[24-25]證明過氧化氫酶可以用作敏感菌株生長培養基的良好添加劑。通過從上海市東海海水與藥廠潔凈環境中篩選出8株高過氧化氫酶活性菌株，從中提取各菌株的無菌體粗過氧化氫酶發酵液。比較了8株篩選菌株的粗過氧化氫酶發酵液對輻照培養基適用性的影響。結果如圖5所示，具有高過氧化氫酶活性的菌株粗酶發酵液對受過氧化氫脅迫的敏感菌生長有復蘇作用。菌株GL3的粗酶發酵液對敏感菌的促生長作用效果相較于其他產過氧化氫酶的菌株效果最好。因此決定對菌株GL3進行進一步的研究。

圖5 粗酶發酵液對培養基適用性的影響Fig.5 The effect of crude enzyme fermentation broth on the suitability of medium

2.3 菌株GL3產酶條件的優化及應用結果

2.3.1 顯著因素的篩選結果

根據《伯杰細菌學手冊》(第九版)并參考《常見細菌系統鑒定手冊》的部分方法對菌株GL3進行生理生化鑒定并將菌株GL3的16SrDNA基因序列進行在線Blast比對分析。根據GL3的形態特征、生理生化鑒定結果以及GL3的16S rRNA基因序列的系統發育樹，將GL3鑒定為堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)并命名為BacillusfirmusGL3。利用PB設計對影響B.firmusGL3的產過氧化氫酶活性的的8因素進行篩選。篩選出最顯著因素，實驗設計及結果如表2所示。利用Minitab17對表2數據進行分析，結果表明回歸方程顯著(P=0.001)，R2=0.999 7表明該模型可信。

表2 Plackett-Burman實驗的設計及其響應值表(N=12)Table 2 The design and response table of Plackett-Burman experiment

PB實驗模型方差分析結果如表3所示，顯著性排序為Mg2+含量>培養時間>NaCl>裝液量>H2O2含量>初始pH>接種量>培養溫度，P<0.05的因素對響應面有顯著影響，因此進一步選擇Mg2+(g/L)、培養時間(h)、NaCl(g/L)3個顯著影響因素進行優化研究。

2.3.2 顯著因素響應面優化結果

通過對響應面的中心復合設計得到NaCl、培養時間、Mg2+的最佳組合。酶活性的優化預測結果見表4所示，當NaCl為11.24 g/L，培養時間18.09 h，Mg2+為0.54 g/L時，預測B.firmusGL3產過氧化氫酶活性高達21 013.8 U/mL。為了驗證響應面所得的最佳產酶活性條件的可實施性，在實際實驗條件,NaCl為11.24 g/L，培養時間18 h，Mg2+為0.54 g/L為最佳產酶活性條件，分別進行5次平行實驗，所得B.firmusGL3的過氧化氫酶活性為(20 668±103) U/mL，結果與預測值基本一致，證明優化模型有效。

表3 Plackett-Burman實驗的分析結果Table 3 Analysis results of the Plackett-Burman experiment

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)

表4 過氧化氫酶活性的優化預測結果Fig.4 Optimization prediction results of catalase activity

2.3.3 優化后B.firmusGL3粗酶發酵液應用結果

菌株B.firmusGL3產高過氧化氫酶活性的條件通過響應面優化后，結果相比未優化的過氧化氫酶活性提高了78.84%。優化后B.firmusGL3粗酶發酵液應用結果如圖6所示，以未接種菌株B.firmusGL3的液體發酵液作為空白對照，將優化過的菌株B.firmusGL3產生的過氧化氫酶粗酶發酵液無菌添加到輻照的TSA培養基后，優化后的粗酶發酵液對2種供試敏感菌金黃色葡萄球菌ATCC 6 538和人參土芽孢桿菌的具有促生長作用。由圖6可知優化后的粗酶發酵液對2種供試菌的促生長作用效果最佳，且趨向于純過氧化氫酶的作用效果。

圖6 優化的B. firmus GL3粗酶發酵液的應用結果Fig.6 Optimized application results of B. firmus GL3 crude enzyme fermentation broth

3 結論

本實驗對輻照的TSA培養基進行適用性檢查發現，標準菌株金黃色葡萄球菌ATCC 6538與人參土芽孢桿菌在輻照TSA培養基上的菌落回收率低于50%，結果表明商業TSA培養基經輻照終端滅菌后產生有毒物質抑制了2種供試菌的生長。在輻照培養基貯存15 d以后，輻照TSA的培養基中2種供試菌恢復正常生長；同時發現還原性化合物焦性沒食子酸與五倍子酸，氨基酸L-半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸，金屬離子Mg2+、Mn2+、K+以及高過氧化氫酶菌株的粗酶發酵液對輻照培養基中敏感菌株的恢復生長有一定的作用。

盡管國內外對于微生物產過氧化氫酶的研究一直沒有中斷，但相對于它們的潛力，大多數商業過氧化氫酶都無法承受惡劣的工藝條件并且在實際的工業領域規模化生產中報道的微生物過氧化氫酶還未獲得廣泛應用[26-27]。因此開發高活性、穩定的、新型微生物過氧化氫酶迫在眉睫，本研究通過前期篩選分離得到的高過氧化氫酶菌株GL3，經生理生化鑒定將其命名為B.firmusGL3。通過響應面優化實驗將菌株B.firmusGL3產過氧化氫酶活性提高了78.84%，優化后的粗酶發酵液對2種供試菌的促生長作用效果最佳，與純過氧化氫酶的作用效果基本一致。因此，優化的B.firmusGL3的過氧化氫酶粗酶發酵液不僅對改善輻照培養基適用性具有重要作用，也為工業生產過氧化氫酶及其應用提供參考依據。