超高壓對乳清分離蛋白結構和抗氧化活性的影響

龐佳坤，鄭遠榮，劉振民*，包怡,3，陳森怡，黨慧杰

1(乳業生物技術國家重點實驗室，上海乳業生物工程技術研究中心，光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海，200436)2(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)3(上海大學 生命科學學院，上海，200444)

乳清是以牛乳為原料生產干酪過程中的主要副產品之一。而乳清蛋白是乳清的主要固形物之一，具有較高的營養價值和生物利用效率，被廣泛的應用于各種食品中。乳清蛋白主要由β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白及其他多種活性成分組成。其中，β-乳球蛋白、α-乳白蛋白分別約占乳清蛋白的50%和19%，均為球狀蛋白質。乳清蛋白產品可以分為蛋白質含量在35%～85%的乳清濃縮蛋白(whey protein concentration，WPC)和蛋白質含量在90%以上的乳清分離蛋白(whey protein isolates，WPI)等。

超高壓(ultra-high pressure, UHP)是一種非熱處理技術。通過將樣品密封于腔體中，以水或其他流體作為傳壓介質，在儀器內部瞬時且均勻的將壓力傳送至樣品。超高壓技術能夠使蛋白質發生結構變化，從而改變蛋白質的功能特性。超高壓一般不會改變蛋白質的共價鍵及氫鍵，對一級結構基本無影響，但會明顯改變蛋白質的非共價鍵，從而影響其高級結構[1]。超高壓技術對蛋白質結構構象的影響是一種復雜的現象，與蛋白質的種類、濃度、壓力大小、施壓時間、溫度和pH有關[2]。

近年來，超高壓技術在食品中有著廣泛的應用，研究表明經過20 min和 400 MPa處理的干酪抗氧化性能顯著提高[3]。將超高壓技術應用于蛋白質含量更高的WPI時，發現超高壓處理可以增強其抗氧化活性，這可能與蛋白質內部結構的部分瓦解及埋藏于乳清蛋白內部的疏水區域暴露有關。WPI中3種主要蛋白對超高壓的抵抗能力的大小為β-乳球蛋白>免疫球蛋白>α-乳白蛋白[4]。并且蛋白質結構的改變可能會導致暴露出更多的酶切位點，從而提高后續蛋白酶水解的效率，因此超高壓也是一種有效的預處理方式[5]。但由于WPI包含了種類繁多的蛋白，因此各種蛋白之間的存在使得超高壓誘導的變性機制變得十分復雜。例如，超高壓處理容易使得免疫球蛋白的球狀結構展開，從而有利于免疫球蛋白通過二硫鍵與其他的蛋白結合而形成聚集體[6]。本研究的目的是對WPI進行不同壓力和時間條件下的超高壓處理，以考察超高壓處理條件對WPI結構和抗氧化活性的影響，為超高壓技術在乳清蛋白產品中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清分離蛋白(WPI，蛋白質質量分數90%)，購于馬可瑞斯商貿(上海)有限公司；其他所有試劑均為分析純。FPG7100型超高壓，德國IKA公司；SepectraMax M5酶標儀，美國Molecular Devices公司；Nicolet6 700傅里葉紅外光譜儀，美國Waltham公司；SPECORD-205紫外分光光度計，德國analytikjena公司； PROTEAN3電泳儀，美國Bio-Rad公司；Geldoc-XR+凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超高壓處理

配制WPI溶液(10 g/L)，將100 mL的WPI溶液分裝于聚乙烯袋中并真空包裝，置于超高壓容器中。考察超高壓壓力(100、200、300、400、500、600 MPa)、時間(5、15、30 min)等因素對WPI的影響。

1.2.2 SDS-PAGE電泳檢測

將不同處理前后的WPI(1 mg/mL)分別取樣進行SDS-PAGE電泳，采用15%分離膠，5%濃縮膠，上樣量為10 μL，電泳初始電壓為100 V，待樣品進入分離膠時電壓調至200 V，待樣品泳動至距凝膠底部0.5 cm處停止電泳。

1.2.3 表面疏水性的測定

參考KATO等[7]的方法，進行表面疏水性(surface hydrophobicity, Ho)的測定。采用1-苯胺基-8-萘磺酸(1-anilino-8-naphthalisene sulfonate, ANS)作為熒光探針。用pH 7.0的PBS(10 mmol/L)連續稀釋經超高壓處理后的WPI樣品，使其最終濃度為0.062 5～1 mg/mL。在稀釋過后的2 mL WPI樣品溶液中，加入10 μL的ANS(8.0 mmol/L)，振蕩后靜置3 min。利用SepectraMax M5酶標儀，在390 nm(激發波長)與470 nm(發射波長)的條件下，測定其熒光強度。表面疏水性Ho值用熒光強度與WPI濃度比值的斜率表示。

1.2.4 乳清分離蛋白結構分析

1.2.4.1 傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrum, FTIR)被用來分析不同超高壓處理前后WPI的構象變化。稱取WPI樣品的凍干粉與干KBr混合，壓片后，利用傅里葉紅外光譜儀進行掃描(4 000～400 cm-1)。

1.2.4.2 自由巰基含量測定

參考AMBROSI等[2]的方法，進行自由巰基含量的測定。250 μL的WPI樣品和1 mL 的Tris-甘氨酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 8.0，含有0.1 mol/L甘氨酸，8 mol/L尿素)進行混合，隨后加入10 μL的Ellman’s 試劑(4 mg/mL)。室溫(25 ℃)孵育30 min后，測量412 nm處的吸光度(A412)。自由巰基的含量通過公式(1)進行計算。

(1)

式中：A412，412nm處吸光度；D，稀釋度；C，WPI中的蛋白濃度，mg/mL；自由基含量巰，μmol/g蛋白。

1.2.4.3 內源熒光光譜分析

參考GINA等[8]的方法，將不同超高壓處理前后WPI樣品利用酶標儀進行色氨酸內源性熒光測定。激發波長設定為280 nm，掃描300～400 nm的發射光譜。

1.2.5 乳清分離蛋白抗氧化活性的測定

1.2.5.1 ABTS自由基清除能力的測定

參考ATHIRA等的方法[9]，測定ABTS自由基清除活性。在20 mL 7 mmol/L ABTS溶液中加入2.45 mmol/L過硫酸鉀，制成40 mL ABTS+·工作液，使用前室溫避光靜置12～16 h。之后將ABTS+·工作液用PBS稀釋至合適的倍數(20～50倍)，使734 nm下的吸光度為(0.70±0.02)。取5 μL的WPI樣品加入到500 μL稀釋后的ABTS+·工作液中。室溫反應6 min后，測定734 nm處的吸光度。清除率通過公式(2)計算，結果用1g WPI中Trolox當量表示(μmol TE/g 蛋白)。

(2)

式中：As，加入樣品后ABTS+·工作液吸光度；Ab，空白對照組吸光度；Ad，未加樣品時ABTS+·工作液的吸光度。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力的測定

參考BRAND-WILLIAMS等[10]的方法，測定DPPH自由基清除活性。將1 mL WPI樣品加入到4 mL的DPPH溶液(60 mmol/L)中。室溫避光反應30 min后，測定517 nm處的吸光度。清除率通過公式(3)計算，結果用1g WPI中Trolox當量表示(μmol TE/g 蛋白)。

(3)

式中：A0，DPPH溶液吸光度；A1，樣品+DPPH溶液吸光度；A2，樣品溶液吸光度。

1.2.5.3 總還原力的測定

參考YEN等[11]的方法測量WPI的總還原力。將200 μL的WPI樣品加入到0.5 mL PBS(0.2 mol/L，pH 6.6)和0.5 mL鐵氰化鉀(10 g/L)中。50 ℃反應20 min后加入0.5 mL三氯乙酸(100 g/L)。3 000 r min條件下離心10 min，取0.5 mL上清液與0.5 mL去離子水、0.1 mL三氯化鐵 FeCl3(1 g/L)混合，反應10 min后，測定700 nm處的吸光度。吸光度越高，說明樣品還原能力越強。結果用1g WPI中Trolox當量表示(μmol TE/g 蛋白)。

1.2.6 統計分析

所有實驗均平行測定3次，數據用平均值±標準差表示。采用Excel及GraphPad prism 7.04軟件對所得到的數據進行統計分析，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 超高壓對乳清分離蛋白電泳特性的影響

超高壓處理后WPI的電泳特性如圖1所示，超高壓處理前后的WPI電泳條帶均位于14.4、18.4 kDa附近，這與WPI的蛋白成分保持一致，WPI的主要成分β-乳球蛋白的分子質量為18 kDa左右、α-乳白蛋白的分子質量為14.4 kDa左右。不同超高壓處理后的WPI的電泳特性并沒有發生顯著改變，各條帶之間差異不明顯。這表明超高壓處理并未引起WPI分子質量的改變，且WPI未降解。

圖1 WPI 的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of WPI注：M-蛋白質標準品，WPI-未處理樣品，A1-100 MPa，5 min，A2-100 MPa，15 min，A3-100 MPa，30 min，B1-200 MPa，5 min，B2-200 MPa，15 min，B3-200 MPa，30 min，C1-300 MPa，5 min，C2-300 MPa，15 min，C3-300 MPa，30 min，D1-400 MPa，5 min，D2-400 MPa，15 min，D3-400 MPa，30 min，E1-500 MPa，5 min，E2-500 MPa，15 min，E3-500 MPa，30 min，F1-600 MPa，5 min，F2-600 MPa，15 min，F3-600 MPa，30 min

2.2 超高壓對乳清分離蛋白表面疏水性的影響

氨基酸殘基的非極性側鏈基團之間的疏水相互作用對維持蛋白質三級結構的穩定具有重要作用，因此表面疏水性常被用于評價蛋白質的三級結構[12]，并且疏水基團能夠加強蛋白質與疏水性多不飽和脂肪酸互作，使蛋白質與氧結合或抑制脂質中氫的釋放，從而保護脂質體系、膜質的完整性，起到抗氧化作用[13]。超高壓對WPI表面疏水性的影響如圖2所示，與對照組即未處理的WPI相比，100 MPa處理后的WPI表面疏水性無顯著變化，超高壓200 MPa及以上壓力處理后WPI表面疏水性則顯著上升。這可能是由于蛋白質分子展開，使原先包埋在球狀蛋白質分子內部的疏水基團暴露在表面，導致了表面疏水性增加。當壓力一定時，WPI的Ho值隨著時間的增加而增加。當保壓時間分別為5 min和15 min時，WPI的Ho值隨著壓力的增加而增加，這表明蛋白質疏水區的暴露程度隨著壓力的增大而增加。當保壓時間為30 min時，WPI的Ho值在400 MPa達到最大值(2 121.4)，之后隨著壓力的增加Ho值略有下降。這可能是由于當保壓時間過長時，較高的壓力使蛋白質疏水氨基酸暴露過多導致更易發生疏水反應，使得展開的蛋白質分子重新聚集形成新的聚合體而導致檢測到的疏水性氨基酸殘基減少[14]。而有研究表明[14-16]，超高壓處理后，大豆蛋白分離物的Ho值隨壓力的增加呈現先上升后下降的趨勢，花生分離蛋白則隨壓力增加呈現持續上升趨勢，這說明不同種類的蛋白質所受壓力的影響存在差異。

圖2 不同超高壓處理對WPI表面疏水性的影響Fig.2 Effects of different UHP treatments on surface hydrophobicity of WPI注：小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.3 超高壓對乳清分離蛋白二級結構和三級結構的影響

2.3.1 超高壓對乳清分離蛋白二級結構的影響

酰胺I帶通常用于分析蛋白質的二級結構，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲。通過適當的擬合、分峰和峰面積計算，可以比較WPI中二級結構含量的變化[17]。從上述實驗中選取具有顯著性差異，壓力分別為200、400、600 MPa，時間為5 min、30 min的實驗組進行傅里葉變換紅外光譜分析，考察超高壓對WPI二級結構的影響。由表1可以看出，超高壓處理過后WPI的α-螺旋含量顯著升高，其中400 MPa-30 min的α-螺旋含量顯著高于其他實驗組。當壓力達到600 MPa時，WPI的α-螺旋含量反而降低，這可能是發生了解螺旋現象。超高壓處理后WPI的β-折疊的含量顯著降低，在400 MPa-30 min時降至最低，這可能與蛋白質的部分展開有關。當壓力達到600 MPa時，WPI的β-折疊含量反而升高，這可能是發生了一定程度的重新折疊。β-轉角的含量在400MPa-5 min 和400 MPa-30 min時達到最高。無規則卷曲的含量與對照組相比顯著降低。這些結果表明，超高壓處理可以使WPI的結構展開，使β-折疊和無規則卷曲轉變為α-螺旋和β-轉角，降低β-折疊的含量，對WPI的二級結構產生顯著影響。

表1 超高壓處理前后WPI二級結構分析Table 1 Secondary structure analysis of WPI before and after UHP treatments

2.3.2 超高壓對乳清分離蛋白三級結構的影響

自由巰基(—SH)及二硫鍵(—S—S—)對蛋白質結構起著重要的作用，并且有研究表明含巰基的半胱氨酸對蛋白質的抗氧化活性具有影響[18]。超高壓處理對WPI巰基的影響如圖3所示。超高壓處理后，WPI的自由巰基含量發生明顯變化，這是由于超高壓使得蛋白質分子內或分子間發生—SH/—S—S—互換反應，使得自由巰基和二硫鍵相互轉化。對照組即未處理的WPI自由巰基含量為12.46 μmol/g蛋白，超高壓處理后的WPI自由巰基含量明顯增加，在400 MPa-30 min時提高了49%，達到最大值(16.63 μmol/g蛋白)。由圖3可以看出，當壓力一定時，保壓時間越長，WPI的自由巰基含量越高，表明超高壓對WPI 的影響與保壓時間相關，這與HINRICHS等[19]的研究一致。而在相同的保壓時間下，隨著壓力的增加，WPI自由巰基含量呈現先上升后下降的趨勢。KLEBER等[5]認為蛋白質在受壓變性的過程中存在一個壓力閾值，低于壓力閾值時蛋白質的展開是可逆的。因此當壓力為200 MPa時，WPI受壓后發生可逆展開，壓力釋放后蛋白質發生一定程度的重新折疊。當壓力為600 MPa時，WPI發生不可逆的變性聚集。當壓力為400 MPa時，WPI變性伸展，暴露出最多的巰基基團，這與JOSEFINA等[20]的結果類似。

圖3 超高壓處理對WPI自由巰基含量的影響Fig.3 Effects of different UHP treatments on free sulfhydryl contents of WPI

WPI中的色氨酸、苯丙氨酸等氨基酸能夠發射熒光，因此常常被用作內源性探針檢測蛋白質三級結構的構象變化[21]。因此WPI的色氨酸熒光光譜可以反應出WPI的結構變化。熒光強度的變化以及圖譜的藍移和紅移反應了氨基酸側鏈發生改變[22]。由圖4可知，與對照組即未處理的WPI相比，200 MPa-5 min、200 MPa-30 min、400 MPa-5 min組的WPI熒光強度略有下降，而400 MPa-30 min、600 MPa-5 min、600 MPa-30 min組的WPI的熒光強度則顯著增強。所有實驗組的圖譜發生均發生明顯紅移。在相同壓力下，隨著保壓時間的增加，WPI的熒光強度也隨之增強。在相同保壓時間下，隨著壓力的增加，WPI內源熒光強度也隨之增強。并且400 MPa條件下的WPI熒光強度不僅高于200 MPa，400 MPa-30 min組的熒光強度還略高于600 MPa-5 min組，600 MPa-30 min組的熒光強度達到最大值，熒光強度的變化表明超高壓處理后色氨酸殘基在溶劑中的暴露量發生變化[23]。超高壓處理使得蛋白質展開導致色氨酸殘基在溶劑中的暴露量改變，這些結果證實了超高壓處理對WPI的變性作用。

圖4 超高壓處理前后WPI內源熒光光譜Fig.4 Endogenous fluorescence spectra of WPI before and after UHP treatments

2.4 超高壓對乳清分離蛋白抗氧化活性的影響

抗氧化劑的抗氧化活性是由不同的機制所引起的，包括DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性、總還原力，或是這些因素的組合[24]，較高的ABTS值、DPPH值和還原力值代表著較高的抗氧化活性。有研究表明[25]，超高壓處理會導致冰沙的抗氧化活性增加。超高壓處理WPI對抗氧化活性的影響如表2所示，與對照組即未處理的WPI相比，經過超高壓處理的WPI明顯具有更高的ABTS自由基清除活性、DPPH自由基清除活性和總還原力。但與對照組(0.7±0.07)相比，200 MPa-5 min組的DPPH自由基清除活性略有降低。

由表2可以看出，在保壓時間為5 min的情況下，壓力越大，WPI的ABTS自由基清除活性越大。在保壓時間為30 min的情況下，WPI的ABTS自由基清除活性隨壓力的增加呈現先上升后下降的趨勢，在400 MPa-30 min組時達到最大值，且差異顯著，DPPH自由基清除活性也顯示出了相同的趨勢。在壓力為200 MPa和400 MPa時，WPI的ABTS自由基清除活性和DPPH自由基清除活性均隨著保壓時間的延長而增加，而當壓力為600 MPa時，ABTS自由基清除活性和DPPH自由基清除活性反而隨著保壓時間的延長而降低。WPI的還原力則是在200 MPa時，隨著保壓時間的延長而略有降低，在400 MPa和600 MPa時，隨著保壓時間的延長而增加。在保壓時間一定時，壓力越大，WPI的還原力也越大。

超高壓處理對WPI抗氧化活性的影響，可能與蛋白質高級結構和構象的變化有關。超高壓處理導致蛋白質發生一定程度的展開，結構發生變化，使原本埋藏在天然蛋白結構內部的活性基團如疏水基團等暴露于溶劑中，因此增強了自由基清除能力導致抗氧化活性的提高。

表2 超高壓處理對WPI抗氧化活性的影響Table 2 Effects of different UHP treatments on antioxidant activity of WPI

注：TE=Trolox 當量

3 結論

本研究通過對WPI進行不同壓力和時間條件下的超高壓處理，以考察超高壓處理條件對WPI結構和抗氧化活性的影響。相對于未經處理的WPI，200 MPa及以上壓力處理后WPI的表面疏水性顯著上升(P<0.05)，在400 MPa-30 min時達到最大值(2 121.4)，而100 MPa的超高壓處理則對WPI的表面疏水性無顯著影響(P>0.05)。這可能是由于一定的壓力使蛋白質分子展開，原先位于WPI內部的疏水區域暴露在表面，導致表面疏水性增加。對于WPI的二級結構，超高壓處理后使WPI 的結構展開，β-折疊和無規則卷曲轉變為α-螺旋和β-轉角，降低β-折疊的含量，對WPI的二級結構產生顯著影響。對于WPI三級結構，自由巰基含量在400 MPa-30 min時提高了49%，達到最大值，這表明壓力使WPI變性伸展，暴露出最多的巰基基團。并且400 MPa-30 min的WPI內源熒光強度與對照相比也表現出了顯著變化，證明了超高壓處理引起色氨酸殘基的變化，導致WPI三級結構展開。在所有的超高壓處理條件中，400 MPa-30 min對WPI結構的影響最為顯著，并顯示出了最高的抗氧化活性。

綜上所述，超高壓處理能顯著改變WPI的二、三級結構，從而對抗氧化活性產生影響。本研究為超高壓技術在乳清蛋白產品中的應用提供了科學依據，有利于促進超高壓技術在乳制品加工領域的應用。