羅伊氏乳桿菌凍干保護劑的優選及高密度凍干工藝優化

譚莎莎，馬方勵，崔樹茂*，毛丙永，唐鑫，趙建新，張灝，陳衛

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(無限極(中國)有限公司，廣東 廣州， 510623)

羅伊氏乳桿菌是目前報道的可存在于所有脊椎動物和哺乳動物腸道內的乳酸桿菌[1-2]，它能夠很好地黏附在腸黏膜上，調節腸道菌群結構，提高免疫力,促進人體健康[2]。乳酸菌通常采用真空冷凍干燥進行制備。真空冷凍干燥是將被干燥物料中的水凍結成冰，然后使冰升華而除去水的一種干燥方法[3]，其基本原理是在低溫低壓下傳熱傳質[4]。但是菌體在冷凍干燥過程中會有損傷，主要包括機械損傷和溶質損傷。機械損傷是由于低溫時細胞內外冰晶生長產生的機械力量導致的。溶質損傷則是由于凍結過程中細胞間隙內的液體逐漸濃縮，電解質的濃度明顯增大造成的，進而增加了細胞死亡的可能性[5-6]。因此在冷凍干燥過程中需要加入凍干保護劑來提高凍干后活菌數。

最常使用的保護劑有糖類、蛋白質、聚合物等，這些不同分子質量的保護劑以不同的途徑保護著菌體，例如低聚糖等通過穿過細胞壁但不穿過細胞質膜的方式保護著菌體，甘油等通過穿過細胞壁和細胞質膜的方式保護著菌體，蛋白質等能在菌體表面形成蛋白膜，避免菌體暴露于外界環境中遭到損傷[7-8]；另外，還有其他一些物質可能會加強凍干保護劑的保護效果。抗氧化物質能降低保護劑的氧化還原電位, 并消耗試驗過程中的部分氧氣[9]；無機鹽類能滲透進入細胞內部，從而使胞內電解質溶液的濃度升高，進而減少溶質損傷[10]；氨基酸能作為pH調節劑以防止因pH變化導致的大分子物質變性[11]；GSH能維持細胞膜的較高的不飽和度比和飽和脂肪酸的短鏈長度，從而獲得完整的細胞結構[12]；谷氨酸鈉能與水密切作用使干粉保留適量的水分，滿足微生物維持生命的最低需求[13]；甜菜堿則能夠調節細胞滲透壓和離子平衡[14]。通常認為不同保護原理的保護劑復合后會提高菌體的凍干存活率，因此目前乳酸菌的冷凍干燥配方一般混合了多種保護劑即復合保護劑。但不同乳酸菌的凍干保護研究參差不齊，無規律可循。本文系統研究所有類保護劑，總結規律為乳酸菌凍干保護劑的選擇提供明確且簡便的方法。

真空冷凍干燥是一個高能耗過程，如何降低乳酸菌制劑產業化生產的能耗也是凍干研究的重要目標。現代工業中，乳酸菌凍干前菌懸液的干物質含量(即凍干結束干粉得率)通常在15%～20%。提高凍干前菌懸液的干物質含量，可減少菌懸液的體積，從而降低凍干機的使用面積，降低能耗。本文將在得到最優保護劑的基礎上優化凍干前菌懸液的干物質含量，實現高密度凍干，減少凍干機的使用面積以實現降低凍干能耗的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

羅伊氏乳桿菌138-1 (Lactobacillusreuteri138-1)(CCFM8631)，江南大學食品生物技術中心保藏。

1.1.2 試劑

實驗所用的MRS培養基，購自青島海博生物技術有限公司；其余化學試劑(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；巖藻糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、水蘇糖、山梨糖醇、甘油、赤蘚糖醇、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、菊粉、低聚異麥芽糖、抗性糊精、乳清蛋白、膠原蛋白、脫脂乳、谷氨酸鈉、甜菜堿、硫酸錳、硫酸鈉、谷胱甘肽、抗壞血酸等，創賽生物科技有限公司；復合維生素，惠氏制藥有限公司；復合核苷酸(A、C、T、G)，山西萊克生物科技有限公司；腺嘌呤(A)，購自南京鑫越源生物科技有限公司；味之素(I+G)，興化市味之素食品配料有限公司；胰蛋白胨，鄭州盛仁堂生物科技有限公司；大豆蛋白胨，安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設備

GRP-9080型隔水式恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；FE20型pH計、EL3002型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MS 3 basic型渦旋振蕩器，德國IKA公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；ZHJH-C1115B型超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司；泰事達凍干機，西班牙Telstar公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的活化與培養

將置于-80 ℃的甘油保菌管取出，解凍。用接種環沾取菌液后在MRS固體培養基上平板劃線，于37℃恒溫培養箱中培養16～18 h。用接種環從平板上長出的菌落中挑取單菌落，將其接種到5 mL MRS液體培養基中，在37 ℃恒溫培養箱中培養12 h。取200 μL再次接種到5 mL MRS液體培養基中，培養12 h后得到活化后的種子液。

1.3.2 羅伊氏乳桿菌的凍干

以8%的接種量接菌至MRS液體培養基中，37 ℃恒溫培養12 h后8 000×g、4 ℃、20 min離心，去上清。將菌泥與水按質量比1∶1混勻后調pH至6.5左右，再將菌懸液以體積比2∶1與保護劑溶液混合，充分均勻后取1 mL分裝至凍干瓶凍干。

凍干工藝：預凍，控制層板1 h內降溫至-50 ℃，保持4 h；一次干燥，控制層板1.3 h升溫至-30 ℃，保持30 h；二次干燥，控制層板1 h升溫至25 ℃，保持20 h。

1.3.3 保護劑溶液的配制

(1)不同種類保護劑

分別準確稱取糖(醇)類、蛋白質類、聚合物類等各類保護劑20 g，溶解后用蒸餾水定容至100 mL，即保護劑溶液質量濃度為200 g/L。

(2)不同分子量保護劑的復配

保護劑A(質量比1∶1復配)：復合保護劑以兩種保護劑復配且兩者之間1∶1復配，即各100 g/L。

保護劑B(不同質量比復配)：m(低聚異麥芽糖)：m水蘇糖=1∶2時，低聚異麥芽糖70 g/L，水蘇糖140 g/L；m(低聚異麥芽糖)∶m(水蘇糖)=2∶1時，低聚異麥芽糖140 g/L,水蘇糖70 g/L；m(低聚異麥芽糖)∶m(水蘇糖)=1∶3時，低聚異麥芽糖50 g/L,水蘇糖150 g/L；m(低聚異麥芽糖)∶m(水蘇糖)=3∶1時，低聚異麥芽糖150 g/L,水蘇糖50 g/L。

(3)優勢保護劑復配其他類保護劑

低聚異麥芽糖120 g/L,水蘇糖60 g/L,其他類保護劑30 g/L。

糖類保護劑在115℃條件下滅菌20 min，蛋白質和聚合物類保護劑在85℃條件下滅菌30 min。

1.3.4 羅伊氏乳桿菌的高密度凍干

以8%的接種量接菌至MRS液體培養基中，37 ℃恒溫培養12 h后8 000×g、4 ℃、20 min離心，去上清，收集菌泥。選取優化后的凍干保護劑配方配制保護劑，將菌泥干物質和保護劑干物質以質量比1.0∶0.8、1.0∶1.0、1.0∶1.2分別配制成質量分數為9%、17%、23%和29%的凍干體系，分別取1 mL分裝至凍干瓶凍干。凍干工藝同1.3.2。

1.3.5 凍干存活率的測定[15]

將凍干后的菌劑用無菌蒸餾水還原到凍干前的質量，混勻后測定其中的菌落總數凍干存活率如公式(1)所示：

(1)

式中：活菌數的單位為CFU/mL。

1.3.6 凍干前后樣品的活菌計數

采用活菌計數法[16]，取0.5 mL菌液以10倍依次遞增稀釋至3個合適稀釋度，各取1 mL稀釋液注入無菌培養皿中，將已溶化并冷卻至45 ℃左右的培養基傾注15 mL至培養皿中，立即放在桌上手動搖晃混勻，每個稀釋度做3個平行，凝固后倒置于37℃培養箱，培養12 h取出并記錄活菌數。

1.3.7 數據統計與分析

試驗中每個實驗值的測定均為3次平行實驗的平均值，在后期的統計分析中不再重復強調。不同組(>3)之間的顯著性差異通過進行ANOVA進行判斷(Tukey’s檢驗)，兩組之間的顯著性差異通過t檢驗進行判斷(SPSS 16.0軟件)，P<0.05則認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同種類凍干保護劑的保護特性

羅伊氏乳桿菌在不同種類保護劑中的凍干存活率如表1所示。

表1 羅伊氏乳桿菌在不同種類保護劑中的凍干存活率Table 1 Freeze-drying survival rate of Lactobacillus reuteri in different types of protective agents

注：表中不同字母代表顯著性(P<0.05)；a～o代表凍干存活率大～小

目前最常用的保護劑有糖(醇)類、蛋白質類以及聚合物類。糖(醇)類保護劑具有多個羥基，可替代水分子在冷凍干燥過程中與菌體細胞膜磷脂中的磷酸基團或與菌體蛋白質極性基團形成氫鍵，避免細胞膜和蛋白質結構與功能的完整性受到破壞[5,17]；蛋白質類的保護劑能在菌體表面形成蛋白膜，穩定菌體細胞膜，為菌體提供了保護衣，保護菌體不因暴露于外界環境中而受到損傷[8，18]。它也為凍干的菌體提供了疏松、多孔的結構[19-20]；聚合物類保護劑則可以顯著提高生物制品混合溶液的玻璃化轉變溫度，抑制冷凍干燥過程中pH值的劇烈變化等。通常認為不同保護原理的凍干保護劑復合提高菌體的凍干存活率，這也為下面開展不同分子量的凍干保護劑復配奠定了基礎。

為了系統探究這些糖(醇)類、蛋白質類、聚合物類保護劑對乳桿菌的凍干保護效果，將文獻報道過的糖(醇)類、蛋白質類、聚合物類保護劑進行單因素實驗，由表1可知，37種不同保護劑中大部分的保護效果均顯著高于無菌水的對照樣(P<0.05)，低聚糖的凍干保護效果最好，羅伊氏乳桿菌138-1在不同低聚糖保護下的凍干存活率均達到60%左右。

由上述實驗結果可知不能滲透進細胞壁的蛋白質和聚合物的凍干保護效果不好，這可能是由于大分子保護劑是通過“包裹”的形式保護菌體的，所以不能像有些糖(醇)類保護劑那樣可以滲透進細胞壁，在細胞壁和細胞膜之間形成一層糖(醇)溶液保護層，保護細胞膜的功能和完整性。而通常認為的可滲透進細胞膜的赤蘚糖醇、甘油的凍干保護效果也不好，充分說明乳桿菌的凍干過程細胞膜的保護是關鍵因素。不同分子量的糖(醇)類物質隨著分子量的增大，玻璃化轉變溫度升高，更有利于菌體的凍干存活。因此相同濃度下低聚糖較單糖表現出更優的保護效果。

2.2 不同分子質量的凍干保護劑復配對菌體的影響

2.2.1 不同分子質量保護劑以質量比1∶1復配對菌體凍干存活的影響

羅伊氏乳桿菌在不同分子量變合保護劑中的凍干存活率如表2所示。

表2 羅伊氏乳桿菌在不同分子量復合保護劑中的凍干存活率Table 2 Freeze-drying survival rate of Lactobacillus reuteri in different molecular weight complex protective agents

注：*代表與低聚異麥芽糖相比的顯著性，*代表P<0.05，**代表P<0.01，****代表P<0.000 1(下同)

通過分析不同種類的凍干保護劑對羅伊氏乳桿菌的凍干保護作用，證實了大小分子對其保護方式是不一樣的。那么單一保護劑與復合保護劑是否具有相同的凍干保護效果呢？焦琳等[21]在優化嗜熱鏈球菌M5-5菌體細胞的凍干保護劑時選取了3種保護劑，包含小分子保護劑海藻糖、甘油和大分子保護劑：脫脂乳。發現海藻糖、甘油和脫脂乳作為單一凍干保護劑時，菌體細胞存活率最高為47.51%，但應用通過正交試驗確定的大小分子復合保護劑配方后菌體的凍干存活率可達88.41%，提高了2倍左右。袁亞宏和韓德權等[22-23]對保加利亞乳桿菌和植物乳桿菌的凍干保護劑進行優化也得出了相似結論。這些都證明了單一的保護劑并不能滿足冷凍干燥和菌體抵抗外界惡劣條件的要求，所以一般都是按一定配方混合使用。

因此選取不同分子質量的保護劑，大分子(抗性糊精)、低聚糖(低聚異麥芽糖、水蘇糖)和小分子糖(海藻糖、乳糖)兩兩復配進行羅伊氏乳桿菌138-1的凍干。復配后的組別較單一低聚異麥芽糖組沒有顯著性提高，并不和大部分文獻中提出的觀點相同，多種保護劑混合運用效果更好，而且發現如果復配一個效果不好的保護劑反而會降低保護效果。低聚糖和不同低聚糖的復配依然呈現出最好的凍干保護效果。

2.2.2 不同低聚糖以不同比例復配對菌體凍干存活的影響

羅伊氏乳桿菌在不同低聚復合保護劑中的凍干存活率如表3所示。

表3 羅伊氏乳桿菌在不同低聚糖復合保護劑中的凍干存活率Table 3 Freeze-drying survival rate of Lactobacillus reuteriin different molecular weight complex protective agents

注：無顯著性差異(P>0.05)

多數研究表明，復合保護劑因具有不同特性的保護劑，一般情況下按一定比例混合使用后可明顯提高凍干保護效果[24]。但由表3可知，分別將2種低聚糖之間的質量比調整為1∶2、2∶1、1∶3以及3∶1，凍干存活率之間的差異性并不明顯，為60%左右。由此可知道，不同低聚糖以不同比例復配，不影響整體凍干效果。這也進一步證實了低聚糖作為凍干保護劑的優勢假設。

2.3 優勢保護劑復配其他類物質對菌體凍干存活的影響

正如前言所述，凍干保護劑最常用的為糖類、聚合物、蛋白質等，但還有其他一些可能加強凍干保護效果的物質，這些物質以不同的原理對菌體有一定的保護效果。羅伊氏乳桿菌在優勢保護劑復配其他類物質中的凍干存活率如表4所示。將這些可能加強凍干保護效果的物質與低聚糖復配之后，可以發現有的組別的凍干存活率有所提高，但并不顯著。保護效果最好的組合為低聚異麥芽糖+水蘇糖+復合核苷酸(I、G)，凍干存活率為(66.44±2.46)%。而且依舊發現復合保護劑的保護效果較單一保護劑的保護效果沒有顯著性的提高。由此可知，低聚糖的凍干保護效果較好，復配其他已有文獻報道的對菌凍干保護起積極作用的物質未表現出凍干保護效果的提升。

表4 羅伊氏乳桿菌在優勢保護劑復配其他類物質中的凍干存活率Table 4 Freeze-drying survival rate of Lactobacillusreuteri in other protective substances

2.4 菌株的高密度凍干

冷凍干燥需要的時間較長，通常乳酸菌的凍干需要72 h左右，這使得凍干菌制劑的成本高，發展受到限制。另外，在全球能源緊缺的今天，節能降耗亦成為工業發展中不可忽視的問題。然而，凍干制品具有多重優越性，所以降低乳酸菌制劑產業化生產的能耗成為凍干研究的熱點之一。提高凍干前菌懸液的干物質含量，可減少菌懸液的體積，降低凍干機的使用面積和能耗。

羅伊氏乳桿菌在高密度凍干下的存活率如表5所示。由表5可知，m(菌泥干物質)∶m(保護劑干物質)為1∶1.2時效果最好，凍干存活率普遍達到90%左右。也就是說凍干樣品中保護劑干物質比菌泥干物質多時，才能達到較好的保護效果。現在工業上普遍采用15%～20%的總干物質含量，本次實驗將總干物質含量提高到了30%左右，不僅使得能耗大大降低，存活率也保持在了90%以上。制得羅伊氏138-1凍干菌粉活菌含量2 500億/g(2.5×1011CFU/g)。

表5 羅伊氏乳桿菌在高密度凍干下的存活率Table 5 Survival rate of Lactobacillus reuteri underhigh-density freeze-drying

3 結論

(1)低聚糖較單糖(醇)、二糖、多糖、蛋白質和聚合物對羅伊氏乳桿菌具有更好的凍干保護效果，且不同的低聚糖之間無顯著性差異。

(2)不同分子質量保護劑復配后凍干保護效果未顯著提升，且復配保護效果差的保護劑后凍干保護效果反而降低；低聚異麥芽糖和水蘇糖兩種低聚糖的復合與單一低聚糖做保護劑的凍干保護效果無顯著差異，且改變兩者的復配比例后凍干保護效果亦無顯著差異。

(3)低聚糖復配已有文獻報道的對菌凍干保護起積極作用的物質：無機鹽、氨基酸、抗氧化劑、緩沖劑、核苷酸等，未表現出凍干保護效果的提升。

(4)保護劑干物質量高于菌泥干物質量時，提高菌體的凍干存活率。菌泥與保護劑干物質的最優質量比為1∶1.2，凍干前菌懸液的干物質質量分數可提高至30%左右，凍干存活率達93.02%。降低了凍干體積，提高了凍干效率。