過氧化物酶體增殖物激活受體δ下調載脂蛋白F在肝細胞中的表達

沈雪彬， 徐尚華, 林小端

近年來，隨著我國居民生活水平的提高及生活方式的轉變，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)和腦血管疾病等疾病已成為我國一大醫療負擔[1]。迄今為止，冠心病的發病機制尚未完全闡明。如何防治動脈粥樣硬化成為研究難題[2]。過氧化物酶體增殖劑激活受體δ(peroxisome proliferator activated receptorδ，PPARδ)是核激素受體家族中的配體激活受體，在糖和脂質代謝中扮演重要角色。PPAR通過與視黃醇類X受體形成二聚體，結合上游啟動子區或編碼區內的DNA應答元件(peroxisome proliferator response element，PPRE)，調控靶基因的轉錄[3]，對代謝綜合征相關致病基因有潛在的調控作用[4]。載脂蛋白F(apolipoprotein F，ApoF)能選擇性抑制血漿膽固醇酯轉移蛋白(cholesterole stertransferprotein，CETP)的活性，其代謝異常與膽固醇逆向轉運、高脂血癥、動脈粥樣硬化等關系密切[5-6]。本研究擬通過構建全長ApoF啟動子，觀察PPARδ激動劑對ApoF啟動子、mRNA及蛋白表達水平的影響，為心腦血管疾病的防治提供新的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1材料及試劑 HepG2人肝癌細胞株由福建醫科大學消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室提供。限制性內切酶和T4 DNA連接酶(美國NEB公司)；PPARδ激動劑GW0742(美國Sigma公司)；魚精DNA、高保真Taq DNA聚合酶(美國Invitrogen公司)；胰酶、DMEM培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；細胞基因組DNA抽提試劑盒DNeasy Tissue Kit(美國Qiagen公司)；質粒小量抽提試劑盒(上海超世生物科技有限公司)，質粒大量抽提試劑盒(美國Qiagen公司)；逆轉錄試劑盒、Realtime PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；TRIzol(美國Invitrogen公司)；ApoF特異性抗體(美國Pierce公司)；PPARδ抗體(美國Abcam公司)；內參β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)；熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega公司)；Realtime PCR及克隆構建所需的引物及重組載體的測序(中國博尚生物技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1Realtime PCR定量檢測ApoF mRNA水平 細胞加入不同濃度PPAR激動劑GW0742干預細胞后，使用TRIzol提取總RNA，逆轉錄為cDNA。內參GAPDH，ApoF及PPARδ的引物序列見表1，其中GAPDH及ApoF引物序列由福建醫科大學消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室提供，PPARδ引物序列參考文獻[7]。

表1 內參GAPDH，ApoF，PPARδ的引物序列

反應體系為：PCR正向引物 0.4 μL；PCR反向引物0.4 μL；SYBR Premix Ex Taq (2×) 10 μL；ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μL；DNA模板2.0 μL；ddH2O 6.8 μL；總體積20 μL。反應條件：95 ℃ 3 min→95 ℃ 15 s→60 ℃ 30 s，40個循環。

1.2.2Western-blot檢測PPARδ和ApoF蛋白表達 用預冷的PBS洗滌各組HepG2細胞3次，使用細胞裂解緩沖液于冰上裂解細胞5 min，收集至離心管中，經超聲破碎后，加入上樣緩沖液電泳、轉膜、封閉，使用洗膜液洗滌2～3遍；加入一抗孵育20～30 min，繼續洗滌2～3遍，加入二抗，將PVDF膜放置暗盒中曝光，使用掃描儀掃描并分析圖片。

1.2.3ApoF啟動子重組載體構建 從NCBI獲取ApoF啟動子全長序列，按照DNeasy Tissue Kit試劑盒說明提取HepG2細胞基因組DNA，使用高保真Taq DNA聚合酶擴增ApoF上游約2 000 bp的序列(ApoF的基因轉錄起始位點定為+1)，所獲得的PCR條帶經測序公司測序并通過DNAMAN比對無誤。引物序列為：

正向：5′GGGGTACCCCCAACCTGAGCACTGCT3′

反向：5′CCGCTCGAGCCAAATTACCACACAGTCCAGTCATT3′

DNA回收試劑盒回收PCR擴增片段，電泳圖顯示條帶位置正確(圖2)。經上海博尚生物技術有限公司測序無誤。構建ApoF的啟動子全長命名為pGL3B-ApoF。

1.2.4雙熒光報告素酶基因檢測 HepG2細胞轉染pGL3B-ApoF 48 h后，用細胞洗滌液洗滌已轉染pGL3B-ApoF基因的HepG2細胞，并吸凈殘留的洗滌液，加入裂解液裂解細胞10 min，并收集含pGL3B-ApoF及pGL3B的細胞裂解液置于干凈的EP管，離心取上清液至另一干凈的EP管。采用冷光儀(Orion Ⅱ Microplate Luminometer, Berthold Detection Systems)檢測熒光信號。pGL3B-ApoF組及陰性對照組所得熒光素酶活性值均除以各組的pRL-SV40熒光素酶活性值，以平衡各組的轉染效率，獲得相應的熒光素酶校正值。結果以相對的熒光素酶活性值表示。每次轉染均做3個復孔，每次實驗至少重復3次。

1.3統計學處理 采用SPSS 13.0軟件處理，采用方差分析比較GW0742干預后不同組間的熒光活性值及mRNA水平差別。P<0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1PPARδ激動劑干預HepG2細胞對ApoF mRNA及蛋白表達水平的影響 HepG2細胞經不同濃度GW0742(0.1，1，10，25 μmol/L)及不同時間(24，48，72 h)處理后提取細胞RNA，Realtime PCR檢測PPARδ和ApoF的mRNA表達水平，以10 μmol/L的GW0742干預細胞24 h后，Western-blot檢測干預后的ApoF蛋白水平表達變化，其結果提示PPARδ被其激動劑GW0742激活后，ApoF mRNA和蛋白表達水平明顯下降(P<0.05，圖1)。

A：不同濃度的GW0742對PPARδ mRNA表達水平的影響(a～e：對照組及0.1，1，10，25 μmol/L的GW0742濃度下對PPARδ mRNA表達水平的影響)； B：10 μmol/L GW0742條件下PPARδ及ApoF蛋白表達水平的影響； C：不同濃度GW0742條件下ApoF mRNA的水平(與陰性對照組、0.1 μmol/L及 1 μmol/L組比較，●：P<0.05；與10 μmol/L組比較，●●：P<0.05)； D：同一濃度不同時間GW0742條件下ApoF mRNA的水平(與陰性對照組比較，★：P<0.05).圖1 PPARδ激動劑對ApoF mRNA及蛋白表達水平的影響Fig.1 PPARδ agonists affect the expression of Apolipoprotein F mRNA and protein

2.2ApoF啟動子全長基因構建 通過NCBI獲取ApoF距離轉錄起始點上游約2 000 bp的啟動子序列，抽提HepG2基因組DNA，克隆ApoF基因啟動子全長，經過KpnI和XhoI雙酶切鑒定及DNA測序，序列比對正確無誤，電泳圖顯示擴增產物位置正確(圖2)。

圖2 載脂蛋白F啟動子PCR擴增產物Fig.2 PCR products of Apolipoprotein F promoter

2.3PPAR激動劑對ApoF啟動子活性的影響 ApoF啟動子的雙熒光報告基因重組載體與內參表達載體pRL-SV40共轉染HepG2細胞，并使用10 μmol/L的GW0742干預細胞24 h后檢測熒光素值。ApoF啟動子全長pGL3B-ApoF熒光素酶的熒光值設為1，對比干預之后熒光素值的變化，其結果顯示隨著GW0742濃度升高，pGL3B-ApoF熒光素酶的活性明顯下降。當其濃度超過10 μmol/L時，差別有統計學意義(P<0.05，圖3)。

與對照組比較，★：P<0.05.圖3 載脂蛋白F啟動子雙熒光報告素酶基因相對活性的變化Fig.3 The changes of the relative activity of the double fluorescent reporter enzyme gene of Apolipoprotein F promoter

3 討 論

文獻報道，PPARδ可以通過結合靶基因的啟動子進一步促進或抑制靶基因的表達[8]。筆者課題組前期研究發現，ApoF的核心轉錄調控區在啟動子上游1 618 bp范圍內，并進一步通過凝膠電泳遷移率及染色質免疫共沉淀等實驗驗證了其受ETS-1/2和CEPα轉錄因子調控[9]。近期有研究提示，抑制ApoF的表達水平與非酒精性脂肪肝病的發生、發展有關[10]。PPAR能調控ApoM和其他脂代謝通路相關基因的表達，并扮演重要角色[11-12]。PPAR是否對ApoF產生影響尚不清楚。

本研究通過不同濃度的PPAR激動劑GW0742干預肝細胞，檢測ApoF的mRNA水平，結果提示PPARδ可以顯著降低肝細胞中ApoF的mRNA和蛋白表達水平。筆者進一步構建ApoF的全長啟動子，采用雙熒光素酶報告基因檢測ApoF啟動子活性的變化，結果顯示啟動子活性顯著降低，其結果與mRNA及蛋白表達水平的變化一致；此外，通過TFsearch及NUBIScan等轉錄因子預測網站預測ApoF上游啟動子區潛在的核受體結合位點，提示在上游啟動子區+43及+966存在高度匹配的結合位點，故PPARδ有可能通過競爭性地結合上游核受體結合位點，從而抑制ApoF的啟動子活性及表達。筆者推測，PPARδ可能通過調控ApoF的表達，進而在非酒精性脂肪性肝病中扮演重要角色，其結果可為更有效預防和治療代謝綜合征等相關疾病提供有益借鑒。