蛋白質分離純化技術研究現狀與發展趨勢研究

劉奕飛 李明宇

【摘?要】蛋白質是生命活動的物質基礎，是各種生物、各種復雜功能和各種生物大分子的組成成分。蛋白質是生物科學的重要研究對象，如何分離純化蛋白質是生命科學研究的重點之一。以前，沒有辦法從復雜的混合物中提取蛋白質。然而，隨著科學研究實驗的進行和發展，對于每一種蛋白質，都可以選擇分離的方法來生產高純度的產品，其基本手段也很普遍。本文綜述了現有的蛋白質分離純化技術的發展狀況并以某些蛋白提取為例進行舉例分析提出了各項技術分析結果，總結了現有蛋白質分離純化技術的發展狀況并以蛋白提取物進行舉例分析，為以后研究提純蛋白質提供參考方法。

【關鍵詞】蛋白質;純化方法;分離技術

蛋白質的分離純化是研究蛋白質的結構、化學成分和生物學功能的基礎。很明顯，要從復雜的體系中提取蛋白質，同時防止其組成、結構、理化性質的變化以及生物活性的喪失是相當困難的。目前，蛋白質分離純化技術的發展趨向于更加細節化、多樣化技術的綜合使用，但這些方法的基本原理不變，都是以蛋白質的性質作為參考依據。本文主要針對近年來動物蛋白純化方法的應用做了一個綜述，并以以往的具體實驗作了參考，詳細記錄了所用的方法，但要了解的是，在具體的實際工作中應依據不同的要求和實驗條件下操作，主要為以后工作者的研究提供參考方法。

1蛋白質的分離純化提取處理方式

1.1動物組織的細胞破碎

實驗前我們的材料往往是動物的組織，所以第一步是破壞動物組織的細胞，除去大塊的組織塊，主要的方法是物理、化學和生物化學的方法。物理方法分為機械方法和非機械方法。機械方法最常用的是研磨法和勻漿法，主要用機械力粉碎組織細胞。非機械方法主要是通過各種物理要素粉碎組織細胞，有凍結熔化法、超聲波法等。廣泛應用于實驗室的是超聲波破碎技術，其優點是處理少量樣品時操作簡便，節約液體材料。但是，由超聲波產生的化學自由基團可以使某些敏感活性物質變性以及失活，所以處理一些超聲波敏感蛋白酶時應慎重使用。

1.2動物組織中蛋白質的溶劑提取

大多數動物蛋白溶于稀鹽、酸、堿液或水中，但也有一些和脂肪結合的脂肪蛋白易溶于有機溶劑，如乙醇、丙酮等。通常用含鹽的碳氫化合物水溶液，對蛋白質具有高且穩定的水溶性，例如Nacl為溶液，它有利于動物蛋白的溶解，并且，在鹽和蛋白質的結合中，提供了對不硬化特性的保護。堿性蛋白質通常可以用酸性溶液進行提取，酸性蛋白則相反。對陳思聰[3]等人在提取鰱魚中魚肉蛋白質時，因為鰱魚中魚肉蛋白屬于堿性蛋白，所以用偏酸性溶液進行提取，產率達90%左右。

1.2.1水溶液提取法

蛋白質依賴于在溶液中的溶解度，如Na2PO4-NaOH提取馬尾松毛蟲幼蟲的蛋白，提取時注意需要攪拌均勻，使蛋白質充分溶解，從利于蛋白的沉淀方面考慮，溫度要設置在5℃以下操作，由于蛋白質是兩性電解質，所以ph值也會影響沉淀，研究發現，若把蛋白質ph控制在等電點0.5ph以上時，蛋白質的溶解度隨之增加。用此法提取的蛋白測含氮量比稀堿法大大提高。

2蛋白質純化方法及研究現狀

2.1依據蛋白質分子的大小差異的分離技術

2.1.1離心技術

離心技術廣泛應用于各個領域，是分離純化蛋白的重要方法之一，往往需要和其他分離方法共同作用，達到進一步純化分析的目的，包括如差速離心，密度梯度離心等多種方法，差速離心技術室是依據物質分子沉降速度的差異，在實驗過程中將離心機速度由低速到高速逐級遞增，蛋白分子會依次沉降下來，達到分離效果，其特點是離心時間短，但需要反復多次離心尚可達到效果，所得的產物純度也較低，常用于病毒、亞細胞結構的分離純化;密度梯度離心是依據沉降速度的差異和浮力密度的差異來進行分析分離的技術，離心速度固定不變，離心時間長，所得產物純度高，易懸浮且生成區帶，主要用于對核酸、蛋白質復合體、細胞、病毒等物質的分離純化。

2.1.2凝膠層析技術

凝膠層析又叫分子篩過濾，凝膠具有惰性載體的性質，通常所帶電荷為零且具有較弱的吸附能力，在較溫和的操作環境下進行，實驗環境對溫度要求范圍廣，可以不需要有機溶劑，同樣能保持蛋白質活性和理化性質，分子篩凝膠的篩孔大小有區別，所以，把凝膠制成凝膠柱，并且柱子的長度夠長，便會起到“篩子”的作用。具體過程為：蛋白質有形狀、分子量等區別，當大分子的蛋白質通過凝膠柱時，不會進入凝膠分子篩的內部，而小分子的蛋白會進去凝膠分子篩內部，結果便是大分子蛋白由于所經的路徑短會先洗脫下來，而小分子量的蛋白由于會先進入分子篩的內部，這樣凝膠會阻礙蛋白分子的運動，所經路徑長，所以小分子蛋白會后洗脫下來。這種方法對大小物質的篩選能起到很好的篩離功效。所以凝膠層析是根據物質分子量大小來進行分離的手段，因此又稱之為凝膠過濾或排阻層析等。

2.1.3超濾技術

超濾技術是一種以超濾膜為介質的分離技術，膜倆側有壓力差，這是分離的驅動力，膜的材質對膜分離性能起著重要決定作用，膜的上層為活化層，其厚度約0.1-1.0微米，很薄，決定了膜孔徑較小，能很好的截流小分子粒子;下層是支撐層，主要對膜的強度起作用。在蛋白質分離純化中超濾技術具有方便實施，難度相對較小，成本低，效率高等優勢，除此之外，在蛋白質的脫鹽，脫醇，分離分離，內霉素去除等過程中也有廣闊的應用前景。超濾技術成功應用于干酪乳清和大豆乳清中蛋白的脫鹽和回收，蛋白截留率高達94.65%;超濾技術用于雞蛋蛋清蛋白的分離，具體經過倆次純化步驟，可得到高純度蛋白，這也是根據蛋白分子量的大小不同的性質來進行的，此法獲得的蛋白純度為98.7%，含45%的卵清蛋白。超濾技術雖優勢明顯，但實驗過程易產生濃度極化和膜污染等情況，也是目前亟待解決的問題。

2.2改變蛋白質的溶解度的分離純化技術

2.2.1溶劑法

在有機溶劑提取法在實驗室中常用于實驗植物蛋白的提取，例如昂貴的中草藥中有效成分的提取，當將溶劑加入到提前準備的植物材料中時，溶劑會通過細胞壁擴散入細胞內，可溶性物質即被溶解，溶于有機溶劑中，依據的是相似相溶原理。之后可以采用一定的方法將有機溶劑去除，例如加熱蒸發，經干燥即可獲得制品，產量可觀，但在實驗過程中需注意溶劑對人體的危害，避免皮膚直接接觸，除此之外，要保持提取物的分散度，這樣可把所需物質幾乎全部析出。

2.2.2雙水相萃取法

根據親和水性高分子聚合物實際用途，分析水溶液的濃度，形成兩相的結構，當兩種聚合物，一種聚合物與適當濃度或特定溫度下的親液鹽或是兩種鹽（一種是離散鹽，另一種是親液鹽）在雙水相體系中混合形成，其中，水的比例較高，可以形成二水項相關系統。在使用此類方式的過程中，應要具體操作，對蛋白質分析技術進行正規的改革，全面優化處理方式。

2.2.3鹽溶法及鹽析法

鹽析方式在使用期間，主要應用高濃度的中性鹽成分，對蛋白質溶液進行合理的處理后，使離析工作效果能符合規定。最為常用的材料為：硫酸銨成分、硫酸鈉成分與氯化鈉成分等。在實際實驗的過程中，高濃度中性鹽能夠對蛋白質進行分離，去除水花莫物質，并破壞其穩定性。在實際離析期間，需根據蛋白質的實際特點，采取不同的方式對其處理，保證PH值在合理范圍內。同時，在離析期間需保證PH值穩定性，通常情況下，在PH值超過7.1的時候。血清蛋白質與硫酸銨相互融合，就可以沉淀。達到良好的處理效果。同時，在使用此類方式的過程中，還要針對蛋白質的實際分離要求，對其進行合理的分析。徐建國等人在對桑椹籽蛋白提取中，得桑椹籽粕研碎，經加鹽液、浸提、過濾、蛋白質提取液、鹽析、離心沉淀蛋白、冷凍干澡后得蛋白粉末。

2.3基于電荷不同的分離技術

2.3.1離子交換層析技術

在實際處理期間，還要根據電荷的性質，合理選擇離析方式，篩選最佳的離析方式，以此提升處理工作效果。在此期間，層析介質是可以選擇的，分為陽離子層析和陰離子層析，選擇合適的層析介質條件，有利于提升分離效果，以陰離子為介質做交換層析為例，葡聚糖顆粒本身攜帶正電荷，吸附環境中帶負電的蛋白質陰離子，此時用帶有不同濃度的負電離子（如Cl-）溶液進行洗柱。洗脫液中的陰離子會取代蛋白質分子。低鹽濃度時帶電少的蛋白質結合力弱被優先洗滌下來，隨著洗脫溶液中陰離子濃度的不斷提高，帶電量多的結合緊的蛋白質也不斷地被先后洗脫下來。若用酸堿程度不同的緩沖液進行洗柱，隨著層析柱內溶液PH的變化，距離其等電點近的蛋白質由于不帶電荷而被洗脫下來。這樣，利用離子交換層析，便將在洗脫過程中帶電程度不同的蛋白質分離開來了。

2.3.2電泳技術

電泳技術越來越用在食品、環保、工業等各個領域，也是分離純化蛋白質的手段之一。用于蛋白質分離的電泳技術是根據蛋白質分子所帶電荷和荷質比差異進行分離的，離子在給定的電場中運動，一段時間后，不同的離子會由于移動速率的不同在電場中拉開距離，移動方向與離子本身所帶電荷相反，即在電場中運動方向相反，可以根據距離的不同以及與介質的不同等達到分離的目的。

3未來發展趨勢與總結

由于蛋白質特性具有許多不同于其他無機分子，及其他小分子有機物的性質，如：物理化學性質的易改變，本身帶有其他配體、輔基離子等特殊的因子，結構功能也復雜，從而會使得的分離提取出的蛋白結晶過程增加難度。我們回首之前的科學探索，發現多數的結果會具有一定的限制性，能只適用所用的實驗對象，所以到目前為止，我國還沒有研究單一的適合所有蛋白都能提取出來的手段，同樣不能利用合理的措施將純度與分離效果達到最大值，還需要利用物理與化學結合方式對其分離處理，在多種方法共同起作用的情況下，確保蛋白質的分離純度達到所需要求，全面優化技術手段，滿足現代發展方面的需求，提升分離水平。

參考文獻：

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課題：

北京青少年拔尖人才培養計劃，科學課題開題階段聯合培養實施方案

（2020年2-4月），學科名稱：生命科學，培養實驗室名稱：清華大學饒子和實驗室（蛋白質科學國家重點實驗室），導師姓名：饒子和，職稱或職務：教授博士生導師，培養學生姓名及年級：劉奕飛，基地中學：北京師范大學附屬實驗中學，指導教師：李曉輝，職稱或職務：特級教師，北京青少年科技中心北京青少年科技教育協會，二零二零年。

第二作者：李明宇清華大學醫學院基礎醫學系

（作者單位：北京師范大學附屬實驗中學）