日光性角化病中RUNX3和Bcl-2蛋白表達及其臨床意義探討

闞蓓 韓莉 張勇 劉艷 李釩

[摘要]目的：探討日光性角化病中人類相關轉錄因子（RUNX3）、B細胞淋巴瘤-2基因（Bcl-2）蛋白表達及其臨床意義。方法：分別對40例正常皮膚組織、40例日光性角化病皮膚組織及40例基底細胞癌組織進行RUNX3、Bcl-2檢測，通過免疫組化分析RUNX3、Bcl-2陽性表達率，并分析二者的相關性。結果：基底細胞癌組織中RUNX3、Bcl-2陽性表達率分別為95.00%、92.50%高于日光性角化病皮損組織中二者的陽性表達率（80.00%、75.00%），且高于正常皮膚組織（57.50%、32.50%），差異有統計學意義（P<0.05）。RUNX3、Bcl-2在日光性角化病中共同表達陽性28例，共同表達陰性6例，經Spearman相關性分析，RUNX3、Bcl-2在日光性角化病中呈現正相關（r=0.577，P<0.05）。RUNX3、Bcl-2蛋白在肥厚型、萎縮型、鮑溫樣型、棘層松懈型、苔蘚樣型病理亞型日光性角化病中的陽性表達率比較差異無統計學意義（P>0.05）。結論：RUNX3、Bcl-2在日光性角化病組織中高表達，二者陽性表達率呈現正相關，且在不同病理亞型日光性角化病中的陽性表達率無差異。

[關鍵詞]日光性角化病;基底細胞癌;RUNX3;Bcl-2;免疫組化法;陽性表達率

[中圖分類號]R758.1 ? ?[文獻標志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2020）01-0058-04

Expression of RUNX3 and Bcl-2 Proteins in Solar Keratosis and Their Clinical Significance

KAN Bei1，HAN Li1，ZHANG Yong1，LIU Yan1，LI Fan2

（1.Department of Dermatology;2.Department of Pathology，Chengdu Second People's Hospital，Chengdu 610000，Sichuan，China）

Abstract： Objective ?To investigate expression of human runt-related transcription factor 3 （RUNX3） and B-cell lymphoma-2 gene （Bcl-2） in solar keratosis （SK） and their clinical significance. Methods ?R RUNX3 and Bcl-2 were detected in 40 normal skin tissues， 40 actinic keratosis skin tissues and 40 basal cell carcinoma tissues respectively. Immunohistochemistry was performed to analyze positive expression rates of RUNX3 and Bcl-2， and their correlation. Results ?The positive expression rates of RUNX3 and Bcl-2 in basal cell carcinoma tissues were 95.00% and 92.50%， respectively， higher than those in SK skin lesion tissues （80.00%， 75.00%）， and higher than those in normal skin lesion tissues （57.50%， 32.50%）， the differencea were statistically significant（P<0.05）. There were 28 cases with positive expression of RUNX3 and Bcl-2 in SK， and 6 cases with negative expression of the two. Spearman correlation analysis showed that RUNX3 was positively related with Bcl-2 in SK （r=0.577， P<0.05）. There was no significant difference in positive expression rate of RUNX3 or Bcl-2 protein among SK of hypertrophic type， atrophic type， bowenoid type， nikolsky type and lichenification type （P>0.05）. Conclusion ?RUNX3 and Bcl-2 are highly expressed in SK tissues. The positive expression rates of them are positively correlated. And there is no difference in positive expression rate of the two among SK with different pathological subtypes.

Key words： solar keratosis; basal cell carcinoma; RUNX3; Bcl-2; immunohistochemistry; positive expression rate

日光性角化病是常發于老年人的皮膚病，通常被認為是皮膚鱗狀細胞癌癌前病變，多發于男性，主要與長期日曬有關，多見于面部、手背等暴露部位，皮損主要為黃豆到蠶豆大小的角化過度性斑塊，早期和正常膚色較為接近，之后呈現暗褐色，周圍有輕度的紅暈，表面較為粗糙[1]。人類相關轉錄因子（Human runt-related transcription factor 3，RUNX3）為抑癌基因，在許多腫瘤中均呈現出失活狀態，失活機制主要與啟動子區高甲化和雜合性缺失有關，與惡性腫瘤的發生、發展及預后中具有重要作用[2]。B細胞淋巴瘤-2基因（B-cell-lymponma-2，Bcl-2）為細胞凋亡研究過程中受到廣泛關注的癌基因之一，具有抑制凋亡的作用，是凋亡分子機制研究的主要靶分子[3]。本研究探討中RUNX3、Bcl-2在日光性角化病中的表達水平，分析其在日光性角化病發展中的作用和臨床意義。

1 ?材料和方法

1.1 材料：選取筆者醫院2012年5月-2015年2月日光性角化病患者存檔的石蠟標本40例，男性24例，女性16例;年齡49～71歲，平均（55.14±5.71）歲;曝光標本20例，非曝光標本20例。基底細胞癌病變患者存檔石蠟標本40例，男性23例，女性17例;年齡47～74歲，平均（55.23±5.76）歲;曝光標本20例，非曝光標本20例。另選同期正常皮膚標本40例，男性25例，女性15例;年齡48～73歲，平均（55.20±5.87）歲;曝光標本20例，非曝光標本20例。

1.2 方法

1.2.1 試劑：RUNX3兔抗人多克隆抗體（Active Motif公司），Bcl-2多克隆抗體（Santa cruz），PV-9000二步法免疫組化檢測試劑及濃縮型DAB試劑盒（北京中杉生物試劑公司）。

1.2.2 切片制作及免疫組化：標本均通過中性甲醛液進行固定，采用石蠟進行包埋，4μm切片，采用常規免疫組化方法進行試驗，一抗濃度分別為RUNX3（1：300），Bcl-2（1：50），4℃條件下過夜處理。PBS沖洗3次，每次時間為5min，滴加PV-9000試劑1，室溫條件下孵育20min;PBS沖洗3次，每次時間為5min，滴加PV-9000試劑2，室溫條件下孵育20min。PBS沖洗3次，每次時間為5min，進行DAB顯色反應，通過蘇木素染色20s，脫水透明，進行封片。

1.3 結果判定：RUNX3陽性細胞即為細胞質呈現棕黃色顆粒的陽性反應產物，Bcl-2陽性染色即為棕黃色顆粒定位在細胞漿，有時伴有胞膜或（和）核膜呈棕黃色。于低倍鏡下觀察免疫組化表達情況，選擇相對較為集中的10個視野，換取高倍鏡進行陽性細胞計數，依照陽性細胞所占比例以及染色深淺進行等級劃分，共包括4個等級[4]：陽性細胞計數<10%或未染色則為（-）;陽性細胞計數為10%～25%且為黃色染色則為（+）;陽性細胞計數為26%～50%且為黃色染色（++）;陽性細胞計數為51%～75%且為棕黃色染色則為（+++）;陽性細胞計數>75%且為深棕黃染色則為（++++）。

1.4 統計學分析：采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，樣本率比較通過卡方檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 ?結果

2.1 三組RUNX3、Bcl-2的表達情況：40例日光性角化病皮損組織中RUNX3陽性表達率為80.00%（32/40），Bcl-2陽性表達率為75.00%（30/40）;40例正常皮膚組織中RUNX3陽性表達率為57.50%（23/40），Bcl-2陽性表達率為32.50%（13/40）;40例基底細胞癌組織中RUNX3陽性表達率為95.00%（38/40），Bcl-2陽性表達率為92.50%（37/40）。基底細胞癌組織中RUNX3與Bcl-2陽性表達率高于日光性角化病皮損組織，日光性角化病皮損組織中RUNX3與Bcl-2陽性表達率高于正常皮膚組織皮損，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 RUNX3、Bcl-2在日光性角化病中表達的相關性：RUNX3、Bcl-2在日光性角化病中共同表達陽性28例，共同表達陰性6例，經Spearman相關性分析，RUNX3、Bcl-2在日光性角化病中呈現正相關（r=0.577，P<0.05）。見表2。

2.3 RUNX3、Bcl-2蛋白在不同病理亞型日光性角化病中的表達：RUNX3、Bcl-2蛋白在肥厚型、萎縮型、鮑溫樣型、棘層松懈型、苔蘚樣型病理亞型日光性角化病中的陽性表達率比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

2.4 RUNX3、Bcl-2在正常皮膚組織及日光性角化病中的表達特點：40例正常皮膚組織中，RUNX3基因主要表達在表皮基底層細胞和近基底層細胞的細胞質中，并從基底層到角質層中沉陷出染色密度和強度逐漸減弱，而在汗腺、毛囊以及皮脂腺周圍的基底樣細胞中也可見RUNX3的陽性表達，在胞質內呈現棕黃色的顆粒沉積，同時在脂肪細胞和間葉組織細胞中無表達。在40例日光性角化病中，RUNX3主要在表皮基底層和棘層中下約1/3的細胞質內表達，在棘層中部陽性表達則較為散在，基底層細胞質內呈現棕褐色顆粒沉積，棘層細胞的胞質內呈現棕黃色的顆粒沉積，同時染色的密度及強度均減弱，真皮乳頭層有少數淋巴細胞染色呈現陽性。見圖1～2。正常皮膚組織中Bcl-2在上層基底層陽性表達，日光性角化病皮損組織中Bcl-2在胞漿中陽性表達，見圖3～4。

3 ?討論

皮膚為人體最大器官，若長期暴露于外界環境中，尤其是紫外線照射后皮膚可能發生一系列的臨床和組織學改變，嚴重時甚至導致癌前病變或腫瘤[5]。日光性角化病多發于50歲以上的中老年人群，其究竟為早期的鱗狀細胞癌還是癌前病變目前尚未明確定論，可進一步發展為侵襲性鱗癌，是一個由正常組織到鱗癌的中間過程，這一階段細胞生物學行為非常不穩定，因此相對于鱗癌細胞其更易接受向良性轉變的分化誘導[6-7]。此階段若能阻斷癌變進程，則可有效預防其發展成為惡性腫瘤，因此，深入研究該病具有廣泛的應用前景和特殊意義。

RUNX3基因最早在胃癌中作為抑癌基因被發現，其表達和上調失活將影響胃癌的發生與發展，之后在肺癌、直腸癌、瘢痕疙瘩等多種腫瘤病變中均被證實為抑癌基因，抑癌學說最早也是通過RUNX3在胃癌中的研究提出的[8]。RUNX3基因在乳腺癌、胃癌、肝癌、結腸癌等多種腫瘤中均呈現低表達，而在正常組織中呈現出高表達，體現出RUNX3的抑制腫瘤作用[9-10]。然而近年來有學者研究表明RUNX3具有抑癌作用機制，和之前的研究相反，RUNX3基因在鱗狀細胞癌、頭頸部腫瘤、皮膚基底細胞上皮瘤中的表達均高于正常組織，推測出RUNX3的過表達可能與腫瘤的產生有關，RUNX3具有致癌作用[11-12]。RUNX3基因的表達增加或者下降常常伴隨著腫瘤的發生，其表達水平和腫瘤的分期和細胞分化程度以及癌細胞的轉移有密切關系[13-14]。目前關于RUNX3在皮膚癌前病變的作用機制和臨床意義逐漸引起了人們的關注，本研究通過免疫組織化學技術對正常皮膚組織及日光性角化病組織進行染色，研究發現RUNX3基因在日光性角化病組織中的陽性表達率80.00%高于正常皮膚組織57.50%，且基底細胞癌組織中表達率95.00%高于日光性角化病組織，表明RUNX3的致癌作用。Melamed RD等[15-16]研究發現，RUNX3在轉移性黑素瘤、原發黑素瘤、發育不良痣以及普通痣中陽性表達率分別為24%、33%、54%、56%，與本研究結果一致。除此之外本研究還發現基底細胞癌組織中RUNX3陽性表達率較日光性角化病皮損組織更高，說明RUNX3可能與日光角化病組織的進一步惡化有關。本研究中光鏡下正常皮膚組織與日光性角化病組織中RUNX3的表達部位具有一定的差異，接下來的研究過程中可進一步比較分析不同皮膚組織中RUNX3陽性表達分布情況，為臨床診斷提供參考。

Bcl-2是一種和程序性細胞凋亡有關的抑制癌基因，凋亡Bcl-2蛋白在控制線粒體凋亡中具有平衡作用，其比率被認為在誘導細胞的凋亡過程中具有決定性作用，并同時可能縮短細胞的周期，從而促進腫瘤的生長，表達多位于角質形成的細胞基底層、毛乳頭間質細胞以及外分泌腺的透明細胞、皮膚黑色素細胞、淋巴細胞中[17-18]。本研究中Bcl-2在日光性角化病組織中陽性表達率為75.00%，與國內姜莉等[19-20]研究結果相似。分析RUNX3與Bcl-2在日光性角化病中表達的相關性，發現RUNX3、Bcl-2在日光性角化病中呈現正相關，推測RUNX3基因可能通過激活Bcl-2的轉錄，兩者協同發揮作用。本研究中日光性角化病組織中有肥厚型、萎縮型、鮑溫樣型、棘層松懈型、苔蘚樣型幾種病理亞型，其中肥厚型表現為角化過度明顯，角質層高度超過寬度，棘層肥厚，呈現輕中度的乳頭瘤樣增生，核分裂現象較多;萎縮型表現為表皮萎縮，基底細胞層增生，細胞排列較為紊亂、緊密，部分基底細胞核較大;鮑溫樣型表現為全層表皮存在異型細胞增生，與原位鱗癌類似，但其基底層有日光角化病的特點;棘層松懈型表現為基底層不典型細胞上方有棘突松懈，形成不規則的裂隙，裂隙中存在棘層松懈細胞，下方可見芽蕾狀細胞突向真皮乳頭;苔蘚樣型表現為真皮乳頭層以及血管周圍有致密的帶狀淋巴細胞浸潤，比較RUNX3、Bcl-2蛋白在不同病理亞型日光性角化病中的陽性表達率無明顯差異，后續可進一步擴大樣本量進行對比分析。

綜上所述，RUNX3、Bcl-2在日光性角化病組織中高表達，二者陽性表達率呈現正相關，且在不同病理亞型日光性角化病中的陽性表達率無差異。

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[收稿日期]2019-06-22

本文引用格式：闞蓓，韓莉，張勇，等.日光性角化病中RUNX3和Bcl-2蛋白表達及其臨床意義探討[J].中國美容醫學，2020，29（1）：58-61.