魚腥草多糖的制備及其體外抗病毒活性研究

劉苗苗，崔清華，范路路，李忠原，田景振

山東中醫藥大學藥學院，濟南 250355

魚腥草(HouttuyniacordataThunb.)原產于東南部和東南部東北亞國家開花植物，為三白草科植物蕺菜的新鮮全草或干燥地上部分。魚腥草在我國醫學體系中有著悠久的應用歷史，有清熱解毒的功效，可治療肺癰吐膿、痰熱喘咳、熱淋、熱痢、癰腫瘡毒等癥[1]。

現代研究表明，魚腥草具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化、解熱、陣痛、抑制血小板聚集等作用[2-5]。在抗病毒方面，魚腥草對于多種病毒(如HSV-1、HIV、H1N1等)[6,7]均有很好的抑制效果，并且在已經應用于臨床的抗病毒藥物(如蓮花清瘟膠囊、四季抗病毒合劑、魚腥草抗病毒合劑等)的組方中均可見魚腥草。

據報道，魚腥草水提取物能夠抑制單純皰疹病毒1型(HSV)，甲型流感病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)[6]和重癥病毒急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)[8]等病毒的活性。在魚腥草水提物的活性成分中，蘆丁、金絲桃苷、綠原酸等[8]都被證明有著不同程度的抗病毒效果。在水提物中，多糖占據著很大的比例，而天然藥物中所含的多糖類成分通常有著很好的抗病毒作用，如金銀花多糖[9]、香菇多糖[10]、黃芪多糖[11]等。目前魚腥草多糖已經被證實有著多種藥理活性，包括抗氧化[2]、抗補體活性[12]、抑菌[13]、免疫調節[14]以及抑制癌細胞[15]等作用，此外，魚腥草多糖還能夠有效地改善由流感病毒引起的肺炎以及腸道損傷[16]，同時，魚腥草多糖對小鼠諾如病毒也顯示出了良好的抑制能力[17]。然而，魚腥草多糖是否對病毒本身有著直接的抑制作用卻很少有人研究。我們在前期預實驗中發現水提醇沉法處理魚腥草所得沉淀物抗病毒活性高于水提物，而沉淀物中以多糖類成分為主。因此，本實驗以體外抗病毒為指標，提高魚腥草多糖純度，以期為進一步研究提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 藥品及主要試劑

魚腥草飲片，購買于安國市祁澳中藥飲片有限公司(產地：湖南，批號：1805368121)；利巴韋林注射液(rebavinrin injection，山東魯抗辰欣藥業有限公司，批號：1511196821)；Sevage試劑(氯仿:正丁醇 = 5:1)；胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司，批號：20220110)；1640培養基(HyClone公司，產品批號：AAJ207653)；青鏈霉素混合液(美國Gibco公司，批號：15140-122)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Gibco公司Lot：8118102)；胰酶消化液(0.25%Trypsin-EDTA，美國Gibco公司，Lot：1859509)；二甲基亞砜(DMSO，美國Amresco公司，批號：520C0322)；噻唑藍染液(MTT，百賽生物技術有限公司，批號：1636c097)。

1.2 宿主細胞及病毒毒種

人惡性胚胎橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)、人喉癌上皮細胞(Hep2細胞)購自上海生博生物醫藥科技有限公司；柯薩奇病毒B3(Coxsakievirus B3，CV-B3)、腸道病毒71型(Human Enterovirus 71,EV71)、呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)由山東省醫學科學院基礎醫學研究所提供，本實驗室保存。

1.3 儀器

MK3酶標儀(labsystems)；電熱恒溫培養箱；超凈工作臺(蘇州凈化)；生物安全柜(上海力申科學儀器有限公司，HFsafe-1200TE)；全自動高壓滅菌鍋(YMS-280B型，寧波鎮海金鑫)；TDD5M臺式平衡離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)；CKX-31倒置顯微鏡(Olympus公司)；CO2細胞恒溫培養箱(上海力申科學儀器有限公司，HF90)；冷凍干燥機(德國 Christ公司，ALPHA 1-4 LD plus)。

2 實驗方法

2.1 魚腥草水提物的制備

取干燥魚腥草藥材，粉碎，過40目篩。稱取魚腥草粉末200 g置于圓底燒瓶，加入10倍量蒸餾水，加熱回流提取，重復提取3次，每次2 h。藥液過濾，離心(3 000 rpm，5 min)，取離心所得上清液，抽濾，旋轉蒸發器減壓濃縮(70 ℃，-0.085 MPa)至1 g/mL(原藥材比例)，得魚腥草水提濃縮液。取濃縮液400 mL，-20 ℃預凍2 h，-80 ℃冷凍干燥12 h，得到水提物(S1)。其余備用，制備魚腥草多糖。

2.2 魚腥草多糖的不同制備工藝

2.2.1 酶法除蛋白

取2.1項下魚腥草水提濃縮液200 mL，鹽酸調至pH = 2，加1.8%胃蛋白酶，40 ℃水浴10 h，離心(3 000 rpm，5 min)，抽濾，取濾液；加0.5%活性炭，80 ℃水浴1 h除色素，抽濾，取濾液；放置至室溫，80%醇沉48 h，離心，取沉淀，沉淀轉移至蒸發皿中，60 ℃揮干2 h，-20 ℃預凍2 h，-80 ℃冷凍干燥12h，得到干燥產物(S2)，計算得率，同法重復三次。

2.2.2 酶法-Sevag(pH = 7)法除蛋白

取濃縮魚腥草水提濃縮液200 mL，鹽酸調pH至2，加1.8%胃蛋白酶，40 ℃水浴5 h，離心(3 000 rpm，5 min)，上清液抽濾，取濾液，NaoH溶液調至pH = 7，分5次加入Sevag試劑(每次加入量為藥液的1/5)，每次加完后離心取上清液再次加入Sevag試劑。第五次上清液加0.5%活性炭，80 ℃水浴1 h除色素，放冷至室溫，80%醇沉48 h，離心，取沉淀，沉淀轉移至蒸發皿中，60 ℃揮干2 h，-20 ℃預凍2 h，-80 ℃冷凍干燥12 h，得干燥產物(S3)，重復三次。

2.2.3 酶法-Sevag(pH = 4)法除蛋白

取濃縮魚腥草水提濃縮液200 mL，鹽酸調至pH = 2，加1.8%胃蛋白酶，40 ℃水浴5 h，離心(3 000 rpm，5 min)，抽濾，NaOH調至pH = 4，分5次加入Sevag試劑(每次加入量為藥液的1/5)，每次加完后離心取上清液再次加入Sevag試劑。第五次上清液加0.5%活性炭，80 ℃水浴1 h除色素，放冷至室溫，80%醇沉48 h，離心，取沉淀，沉淀轉移至蒸發皿中，60 ℃揮干2 h，-20 ℃預凍2 h，-80 ℃冷凍干燥12 h，得干燥產物(S4)，重復三次。

2.3 魚腥草多糖含量的測定(苯酚-濃硫酸法)

2.3.1 標準曲線的建立

取分析純無水葡萄糖適量，干燥至恒重。精密稱取干燥的葡萄糖60 mg，置于100 mL容量瓶，加水定容，超聲混勻，得葡萄糖對照品溶液。用移液槍取葡萄糖對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于50 mL的容量瓶中，加水定容并超聲混勻，得對照品梯度溶液M1、M2、M3、M4、M5，備用。取對照品梯度溶液M1、M2、M3、M4、M5各2 mL于試管中，各加4%苯酚溶液1 mL混勻再迅速加入硫酸7 mL，搖勻。40 ℃水浴30 min，取出再冰水浴5 min。

以蒸餾水調零并于490 nm處測定吸光度值，每組平行測定三次，取均值。以吸光度A為縱坐標，濃度C為橫坐標，建立標準曲線。

2.3.2 多糖含量的測定

分別稱取S1、S2、S3、S4粉末適量，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加水定容得樣品溶液Z1、Z2、Z3、Z4。取樣品溶液Z1、Z2、Z3、Z4各2 mL于試管中，各加4%苯酚溶液1 mL混勻再迅速加入硫酸7 mL，搖勻。40 ℃水浴30 min，取出再冰水浴5 min。

以蒸餾水調零并于490 nm處測定吸光度值，每組平行測定三次，取均值。代入得出的標準曲線方程中，計算相應的濃度，以及各干燥產物的多糖含量。

2.4 魚腥草抗病毒活性實驗

2.4.1 不同供試液的制備

分別稱取適量S1、S2、S3、S4、2% DMSO的細胞維持液配制為20 mg/mL的溶液，渦旋、超聲10 min以充分溶解。0.22 μm微孔濾膜除菌過濾，分裝至1 mL無菌EP管中，即得Y1、Y2、Y3、Y4。

2.4.2 陽性對照藥的制備

利巴韋林注射液采用原液，濃度為50 mg/mL。

2.4.3 細胞的復蘇與培養

-80 ℃冰箱中取出保存有宿主細胞的凍存管，室溫融化。超凈工作臺內，將細胞懸液轉移到無菌離心管中，離心(800 rpm，5 min)，棄去上清液，加入0.5 mL細胞培養液(10%FBS)，吹打細胞，吸取新得到的細胞懸液轉移至培養瓶內，置于CO2恒溫培養箱(培養條件為37 ℃、5% CO2、相對濕度75%)中培養即可。

2.4.4 病毒的擴增

將0.5 mL病毒液接種于生長狀態良好的宿主細胞上，置37 ℃、5%CO2病毒培養箱中培養，另設細胞對照，加入0.5 mL細胞維持液(2%FBS)，同法培養1 h后，將病毒瓶和對照瓶加入4.5 mL細胞維持液，繼續培養24 h。待90%的細胞發生病變時，反復凍融3～4次，離心(1 000 rpm，5 min)，取上清液定量分裝，置于-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

2.4.5 病毒毒力的測定

取處于指數生長期、生長狀態良好的宿主細胞，將其消化并稀釋濃度為 1×105個/mL，每孔100 μL接種于96孔細胞培養板中，培養24 h，待其長成單層細胞后，棄掉培養液。以10倍比稀釋待測病毒液，共稀釋10個濃度梯度，依次加入到長滿單層細胞的96孔板中，設置4個復孔，另設細胞對照孔。置37 ℃、5% CO2培箱中培養，用倒置顯微鏡觀察，至90%的細胞發生病變時停止培養。每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL染色，于病毒培養箱中培養 4 h，吸棄染液，加入100 μL DMSO，室溫脫色10 min，用MK3酶標儀(labsystems)測定其在490 nm波長的吸光度(OD值)，并計算病毒液的半數感染濃度(TCID50)。

細胞存活率 = 各組OD值/

正常細胞OD值×100%

細胞比距 = (高于50%病變率-50%)/

(高于50%病變率-低于50%病率)×100%

TCID50= Antilg(Ig高于50%CPE百分率病

毒稀釋度+比距×稀釋因子對數)

2.4.6 藥物對細胞毒性的測定

將處于指數生長期、生長狀態良好的宿主細胞，消化并稀釋濃度至1×105個/mL，每孔100 μL接種于96孔細胞培養板中，培養24 h，待其長成單層細胞，棄掉培養液。魚腥草水提液用細胞維持液按2倍比稀釋10個濃度梯度，依次接種于長滿宿主細胞的96孔板中，設3個復孔、空白對照孔及細胞對照孔，于病毒培養箱中培養并觀察細胞病變情況。

2.4.7 抗病毒活性測定實驗

分別將供試液Y1、Y2、Y3、Y4和利巴韋林陽性藥二倍比稀釋10個濃度梯度，取100 μL藥液與等體積100倍TCID50濃度的病毒液相互作用2 h后，接種于單層宿主細胞上，設3個復孔，設為各藥物組和利巴韋林陽性對照組；加入100 μL維持液和100 μL病毒液設為病毒對照組；加入200 μL維持液設為細胞對照組；加入100 μL藥液和100 μL病毒液，另設為無細胞的空白對照組。37 ℃、5% CO2培養箱培養。待病毒對照組細胞出現90%及以上病變時停止培養，采用CPE法記錄藥物抑毒情況，并用MTT 法測定每孔在490 nm波長下的OD值，計算細胞存活率，應用Reed-Muench公式計算藥物半數有效濃度EC50及治療指數(TI)，C為供試品初始濃度。

EC50=[Antilog(高于50%CPE百

分率病毒稀釋度的值-比距)]×C

治療指數(TI)=半數毒性濃度(TC50)/

半數有效濃度(EC50)

3 實驗結果

3.1 魚腥草提取結果

表1 魚腥草不同干燥產物得率

對魚腥草不同干燥產物的質量與得率進行了測定：水提物取400 mL濃縮液直接凍干獲得7.487 8 g凍干粉S1，得率為1.87%；其余三種酶處理水提液各取200 mL濃縮液進行處理并凍干，分別獲得凍干粉S2為2.027 0 g、S3為1.663 0 g、S4為1.754 6 g，得率分別是1.01%、0.83%、0.88%。

3.2 魚腥草水提物不同處理方法產物多糖含量測定結果

3.2.1 標準曲線的建立

依據2.3.1中的方法，計算對照品梯度溶液M1、M2、M3、M4、M5葡萄糖溶液的濃度，并測量各自的吸光度，以對照品梯度溶液的葡萄糖濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，得回歸方程為：A =

13.889C+0.062 5(A-吸光度；C-葡萄糖濃度)；R2為0.999 1。所得回歸曲線：

圖1 葡糖糖濃度曲線Fig.1 Glucose concentration curve

3.2.2 魚腥草水提物不同處理方法產物多糖純度

對樣品溶液Z1、Z2、Z3、Z4進行吸光度測定并計算其多糖的濃度與純度，結果如下表。

表2 不同樣品的多糖濃度

表3 三種病毒的TCID50

注：表()內為病毒各自的宿主細胞。

Note:Table () is the host cell of each virus.

結果如表2所示，S3的多糖純度最高。多糖純度由高到低為S3>S4>S2>S1。

3.3 病毒毒力測定結果

按照上文2.4.5測定EV71、RSV以及CV-B3這三種病毒的病毒毒力以半數感染濃度TCID50來表示，分別如上表所示。其中EV71病毒的宿主細胞是RD細胞，而RSV和CV-B3病毒的宿主細胞是Hep2細胞。

3.4 魚腥草水提取物及3種多糖的體外抗病毒結果

魚腥草水提物不同處理方法所得四種樣品對于這三種病毒則均顯示出一定的抑制作用。

不同形態細胞見圖2、圖3、圖4；抗病毒結果見表4。

圖2 魚腥草多糖體外抗EV71結果Fig.2 Anti-EV71 results of houttuynia cordata polysaccharide in vitro注：A.正常RD細胞；B.EV71病毒感染對照組細胞；C.陽性藥利巴韋林對照組；D.魚腥草有效對照組(魚腥草水提物)。Note:A.Normal RD cells;B.Cells infected with EV71 virus;C.Cells treated with ribavirin;D.Cells treated by houttuynia cordata (water extract).

EV71的宿主細胞 RD細胞在正常狀態下呈現飽滿的梭形狀態，在感染病毒后出現大量細胞死亡現象；在藥物毒性實驗組中，由于藥物自身毒性也使得RD細胞出現死亡的狀況；經過陽性藥利巴韋林以及魚腥草水提物治療過的感染病毒RD細胞存活率與細胞形態出現好轉。

圖3 魚腥草多糖體外抗RSV結果Fig.3 Anti-RSV results of Houttuynia cordata polysaccharide in vitro注：A.正常Hep2細胞；B.RSV病毒感染對照組細胞；C.陽性藥利巴韋林對照組；D.魚腥草有效對照組(酶法-Sevage pH = 7)。Note:A.Normal Hep2 cells;B.Cells infected with RSV virus;C.Cells treated with ribavirin;D.Cells treated by houttuynia cordata (Enzyme treatment Sevag pH = 7).

RSV病毒的宿主細胞Hep2細胞正常狀態呈現飽滿的多邊狀態，感染病毒后出現大量的細胞破裂、死亡；經過陽性藥利巴韋林以及魚腥草水提物治療過的感染病毒Hep2細胞存活率與細胞形態出現好轉。

CV-B3病毒的宿主細胞Hep2細胞正常狀態呈現飽滿的多邊狀態，感染病毒后出現大量的細胞破裂、死亡；經過陽性藥利巴韋林以及魚腥草水提物治療過的感染病毒Hep2細胞存活率與細胞形態出現好轉，且最優的魚腥草水提物組對于病毒的抑制作用較利巴韋林的抑制作用差異較小。

圖4 魚腥草多糖體外抗CV-B3結果Fig.4 Anti-CV-B3 results of houttuynia cordata polysaccharide in vitro.注：A.正常Hep2細胞；B.CV-B3病毒感染對照組細胞；C.陽性藥利巴韋林對照組；D.魚腥草有效對照組(酶法-Sevage pH = 7)。Note:A.Normal Hep2 cells;B.Cells infected with CV-B3 virus;C.Cells treated with ribavirin;D.Cells treated by houttuynia cordata (Enzyme treatment Sevag pH = 7).

表4 魚腥草水提物及3種多糖體外抗病毒結果

圖5 魚腥草水提物及3種多糖體外抗三種病毒TI值比較(t檢驗)Fig.5 Comparison of TI virus values of water extracts and 3 polysaccharides from Houttuynia cordata in vitro (t test)注：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，#P > 0.05。

對EV71的抑制作用，魚腥草水提物不同處理方法所得樣品對其治療指數分別為：Y1-24.05；Y2-2.732 2；Y3-12.593 3；Y4-6.392 2。通過對各組間進行兩兩比較的組間t檢驗(結果如圖5)，發現Y1與Y3之間，雖然Y1在均值上占有優勢，然而兩者組間比較P值大于0.05，沒有顯著區別，可視為效果大致相同；其他各組兩兩比較P值均小于0.05，具有顯著不同。因此可認為這四種產物對EV71的抑制效果優劣為Y1≈Y3>Y4>Y2。

對RSV的抑制作用，魚腥草水提物不同處理方法所得樣品對其治療指數分別為：Y1-2.464 5；Y2-5.431 5；Y3-15.565 3；Y4-9.724 6。對各組間進行兩兩比較的組間t檢驗(結果如圖5)，P值均小于0.05，各組兩兩之間均有顯著區別，可視為效果顯著不同。因此可認為這四種產物對RSV的抑制效果優劣為Y3>Y4>Y2>Y1。

對CV-B3的抑制作用，魚腥草水提物不同處理方法所得樣品對其治療指數分別為：Y1-2.807 6；Y2-5.339 8；Y3-17.86；Y4-5.98。對各組間進行兩兩比較的組間t檢驗(結果如圖5)，發現Y2與Y4之間，雖然Y4在均值上占有一定優勢，然而兩者組間比較P值大于0.05，沒有顯著區別，可視為效果大致相同；其他各組兩兩比較P值均小于0.05，具有顯著不同。因此可認為這四種產物對CV-B3的抑制效果優劣為Y3>Y4≈Y2>Y1。

4 討論

為了探究魚腥草水提物抗病毒能力與其中所含多糖的關系，我們采用酶解法、酶解法-Sevag純化魚腥草多糖，測其多糖含量及體外抗病毒活性，以期找出魚腥草多糖與其抗病毒能力的關系。

從魚腥草經不同制備方法所得提取物的得率及多糖純度結果看，得率方面：S3S4>S2>S1，兩者成反比關系，說明酶解和Sevage法除蛋白可以提高樣品的多糖純度；同時，除去魚腥草水提液直接凍干產物對EV71病毒的抑制效果外，魚腥草的不同處理方法所得凍干產物的抗病毒效果趨勢與其中多糖純度趨勢基本一致，由此可推測魚腥草對RSV、CV-B3兩種病毒的抑制可能主要是魚腥草中的多糖在發揮作用。

魚腥草的水提液凍干產物(Y1)的抗病毒效果在EV71和RSV、CV-B3病毒的抑制效果方面存在很大的差異，魚腥草水提液對于EV71病毒有著最佳的抑制效果，而對于RSV、CV-B3兩種病毒，其抑制作用在四種產物中是最差的，在醇沉的上清液部位可能存在除多糖以外的EV71的抑制劑，其抗病毒的效果及作用機制需進一步研究。

天然藥物多糖抗病毒機制主要有對病毒的直接抑制與滅殺、抑制病毒進行生物合成與增殖、阻滯病毒的吸附與進入細胞、以及對宿主進行免疫調節等[18]。魚腥草多糖有著很好的抗氧化效果[2,19],抗氧化與免疫調節有著密切的聯系，同時，多糖的抗氧化效果對一些病毒的抑制也密切相關[20]。魚腥草多糖在本實驗中展現的抗病毒效果可能與其抗氧化能力相關。

本研究對于魚腥草多糖的體外抗病毒效果進行了一定的研究，為魚腥草多糖的抗病毒能力提供了一定的實驗依據與數據。魚腥草多糖對于RSV和CV-B3病毒的抗病毒作用總體上隨多糖純度的上升而增強，而對于EV71病毒，未經處理的魚腥草水提液的抗病毒作用效果與多糖濃度最高的Y3相似，而其他三種產物的抑制效果依然與多糖純度呈正相關。