核桃內生真菌抗氧化菌株的篩選及其代謝產物活性研究

龐俊倩，趙鑫丹，郝苑汝，高 飛，翟梅枝

西北農林科技大學林學院核桃研究中心，楊凌 712100

由于食品、醫藥等工業的需求，從自然界中尋找天然的、安全的抗氧化劑受到越來越多的關注，植物資源是目前天然抗氧化劑的主要來源。內生真菌是生活在植物組織內，但不對宿主造成明顯病害癥狀的腐生、寄生、共生真菌及細菌等微生物[1]。有研究表明，內生真菌普遍存在于植物組織當中，它們能夠產生與宿主植物相同或相似的生物活性物質,許多活性成分被證明具有明顯的抗癌、抗菌、抗氧化等活性[2]，是獲得抗菌、抗氧化藥物先導化合物的重要來源。植物內生菌中得到的天然抗氧化劑結構新穎，活性顯著，為天然抗氧化活性物質提供了又一豐富的資源。

核桃(JuglansregiaL.)是胡桃科核桃屬落葉喬木，在我國栽培歷史悠久，分布廣泛，資源豐富[3]。核桃各組織本身具有抗氧化活性，Zhang等[4]發現核桃青皮提取物不同溶劑的提取相具有不同程度的抗氧化作用，Wei等[5]研究了核桃葉提取物及其各萃取部分的抗氧化活性，結果表明核桃葉75%乙醇提取物對DPPH·及ABTS+·IC50均低于VC。這些研究表明，核桃不同組織提取物具有較高的抗氧化活性。根據宿主共生理論，內生真菌可以產生與宿主植物相同或相似的化合物，在核桃內生真菌中是否同樣存在高活性抗氧化物質亟待研究。目前，對于核桃內生真菌的研究多集中在多樣性和抗菌方面方面[6,7]，對抗氧化活性的研究報道較少，本研究以期為核桃內生真菌高抗氧化菌株作為天然抗氧化劑的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

供試29株核桃內生真菌，均由本實驗室從宜君、藍田兩地采集不同核桃組織中分離得到，經純化后現保存于西北農林科技大學核桃研究中心實驗室。菌種編號、分離部位、采樣季節以及菌株歸屬見表1。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖固體培養基(PDA)，用于內生真菌的活化培養；馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB)，用于內生真菌的發酵培養。

1.1.3 主要試劑及儀器

主要試劑：VC(上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%)；蘆丁(上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%)；沒食子酸(上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%)；二苯代苦味肼基自由基(DPPH·，純度>97%，東京化成工業株式會社)；2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；試劑均為分析純。

主要儀器：UV-1200 紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；RE-52AA 型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器有限公司)；SKY-2102C型恒溫震蕩培養箱(上海蘇坤實業有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

將4 ℃保存的內生真菌接種于PDA平面固體培養基上，在28±1 ℃下培養4～6天，待菌落長至直徑40～50 mm，保存用于液體發酵。

1.2.2 內生真菌的發酵

在無菌條件下用直徑為6 mm的打孔器在活化好的內生真菌菌落外緣打取菌餅，用接種針接種至含300 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基500 mL錐形瓶中，在28±1 ℃、180 rpm搖床上震蕩培養7天。

1.2.3 發酵產物及不同溶劑抗氧化樣液的制備

發酵產物樣品液制備：發酵液經雙層濾紙過濾，在60～65 ℃、70 rpm的條件下，減壓濃縮至浸膏狀，配成1 mg/mL的樣品溶液，備用。

高活性菌株萃取液制備：高活性菌株大量發酵(方法同1.2.2)，發酵液減壓濃縮至原體積的1/10，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每種溶劑萃取三次，減壓濃縮成浸膏狀，依次得到石油醚提取物(PEE)、乙酸乙酯提取物(EAE)、正丁醇提取物(BAE)及萃余物(WTE)，備用。

1.2.4 DPPH·自由基清除率測定

參照Tan等[8]的方法稍作修改，取2 mL DPPH·(0.1 mmol/L)乙醇溶液，加入2 mL 1 mg/mL樣品溶液，搖勻，室溫避光下靜置30 min，在波長517 nm處測定吸光值。試驗設置3組平行，結果取平均值，并以VC為陽性對照。

1.2.5 總還原力測定

總還原力采用FRAP法，TPTZ工作液配制參考Kaushik等[9]的方法。用VC作標樣，繪制標準曲線，如圖1。

圖1 Vc標準曲線Fig.1 Standard curve of Vc

1.2.6 總酚、總黃酮含量的測定

總酚含量測定釆用福林酚法，參照Rosana等[10]的方法。用沒食子酸作標樣，繪制標準曲線，如圖2(a)。黃酮含量的測定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法[11]，用蘆丁作標樣，繪制標準曲線，如圖2(b)。

1.2.7 數據分析

2 結果與分析

2.1 抗氧化活性菌株的篩選

2.1.1 供試29株核桃內生真菌的發酵產物對DPPH·的清除作用

29株內生真菌的發酵產物對DPPH·清除率結果見表1。

圖2 沒食子酸(a)、蘆丁(b)標準曲線Fig.2 Standard curve of gallic acid(a) and rutin(b)

表1 29株核桃內生真菌的發酵產物對DPPH·清除率

續表1(Continued Tab.1)

編號Strain No.季節Season組織Part (tissue) of the plant屬GenusDPPH·清除率DPPH· scavenging rate(%)LTL-6-6夏Summer交鏈孢霉屬Alternaria11.63±2.01LTS-6-6夏Summer須殼孢屬Pyrenochaeta96.47±0.99LTS-6-4夏Summer黑蔥花霉屬Periconia44.38±0.01LTS-6-1夏Summer交鏈孢霉屬Alternaria52.60±1.58LTL-6-5夏Summer小卵孢霉屬Ovularia26.36±0.88

注：供試濃度：1 mg/mL。

Note:Test concentration:1 mg/mL.

由表1可見，供試29株核桃內生真菌的發酵產物均具有一定的抗氧化活性，但抗氧化活性各不相同。在供試濃度1 mg/mL時，樣品LTS-6-6抗氧化活性能力最強，對DPPH·自由基的清除率為96.47%±0.99%；樣品YJL-3-5、YJL-5-3、YJL-2-4、LTS-3-1、YJL-2-5、LTL-3-1、LTL-5-4和LTS-6-1也顯示了較強的抗氧能力，對DPPH·的清除率均超過50%，其他20個樣品對DPPH·清除率都小于50%，尤其菌株LTS-2-1、LTL-2-2、YJS-5-2的發酵產物的抗氧化能力最弱，DPPH·清除率都小于10%。鑒于此，將對DPPH·清除率超過50%的9株真菌作為活性菌株，進一步考察它們的總還原力。

9株內生真菌發酵產物對DPPH·清除率大于50%的活性菌株。測試樣品對DPPH·呈現出了不同程度的清除作用，從分離部位看，一年生莖2株、兩年生莖3株、葉2株和果2株。由此可看出，活性菌株主要來自于當年生或兩年生組織中。從歸屬來看，5株屬于花核菌屬，即：YJL-2-4、YJL-2-5、YJL-3-5、LTL-3-1、LTS-3-1。在濃度為1 mg/mL時，這5株內生真菌的發酵產物對DPPH·清除率在56.33%～77.16%；2株歸屬為交鏈孢霉屬，清除率在52.60%～56.84%；另外1株來自于派倫霉屬，清除率78.28%；一株來自于須殼孢屬，清除率為96.47%。從分離地點看，來自宜君的4株，來自藍田的5株。綜合分析認為，核桃內生真菌中花核菌屬、交鏈孢霉屬與其他菌屬相比，發酵產物具有較好的抗氧化活性。

2.1.2 較強活性菌株總還原力比較

抗氧化物質的抗氧化活性與其還原力存在著直接的聯系。亞鐵還原能力測定是評價物質抗氧化能力的一種通用的方法，通常物質的還原能力越強，抗氧化能力就越強[12]。對9株DPPH·清除率超過

50%的菌株發酵產物進行總還原力測定。結果如圖3所示。

圖3 活性菌株的總還原力 Fig.3 The total antioxidant capacity of 9 active strains of better DPPH· radical注：A，B，C，D代表顯著性差異，P<0.01。Note:A,B,C,D represent significant differences compared with each other,P<0.01.

由圖3可見，供試9株活性菌株的總還原力依次為：LTS-6-6>YJL-5-3>LTL-3-1>YJL-2-5>LTL-5-4>YJL-3-5>LTS-6-1>LTS-3-1>YJL-2-4。其中，菌株LTS-6-6的總還原力為130.47 mg VC/g，顯著高于其他菌株；其余8株內生真菌的總還原力均在15 mg VC/g以下，總還原力最低的是YJL-2-4，僅為9.54 mg VC/g。故選擇LTS-6-6作為抗氧化高活性菌株進行下一步研究。

2.2 高活性菌株LTS-6-6不同部位萃取物的抗氧化活性評價

2.2.1 高活性菌株LTS-6-6不同萃取物的總酚、總黃酮含量及總還原力

對高活性菌株LTS-6-6各萃取物的總還原力和總酚、總黃酮含量進行測定，結果如表2和圖4所示。

表2 LTS-6-6不同部位萃取物的總酚、總黃酮含量及總還原力

注：A、B、C、D代表顯著性差異，同一指標相互比較，P<0.01。

Note:A,B,C,D represent significant differences.Compared with each other in dependence of the same index,P<0.01.

圖4 LTS-6-6不同部位萃取物的總酚、總黃酮含量及總還原力Fig.4 Total phenol content,total flavonoid and total antioxidant capacity of different extracts from LTS-6-6注：A，B，C，D代表顯著性差異，同一指標相互比較，P<0.01。Note:A,B,C,D represent significant differences.Compared with each other in dependence of the same index,P<0.01.

由表2和圖4可知，就總還原力而言，EAE的總還原力最高，為527.59±10.66 mg VC/g，顯著高于其它溶劑提取物；BAE總還原力居中，為149.08±3.62 mg VC/g；WTE和PEE總還原力最低，分別為60.60±1.28和66.48±0.21 mg VC/g，僅為EAE的1/9、1/8。就總酚含量而言，EAE的含量最高，為641.14±7.50 mg 沒食子酸/g；WTE總酚含量最低，為38.91±0.54 mg 沒食子酸/g。不同溶劑提取物總酚含量之間差異顯著，EAE的總酚含量分別為PEE、BAE、WTE的4倍、7倍、16倍。就總黃酮而言，EAE的總黃酮含量最高，為100.30±8.44 mg/g，分別為PEE、BAE、WTE的3倍、6倍、9倍。

眾多研究[13,14]表明，黃酮類和多酚類物質是天然抗氧化劑的主要物質基礎。在對高活性菌株發酵產物的各萃取物總酚、總黃酮、總還原力測定的基礎上，分析總酚、總黃酮含量和總還原力的相關性，總還原力與總酚、總黃酮含量呈正相關性，相關系數分別為0.8771、0.9177。萃取后，乙酸乙酯部分多酚和黃酮類物質得到富集，含量最高。不同萃取物中的總還原力和總酚含量之間呈現出明顯的量效關系，即總酚和總黃酮含量高的萃取相，總還原力也強。由此推斷，高活性菌株LTS-6-6發酵產物的抗氧化活性物質主要是多酚類和黃酮類。

2.2.2 不同濃度LTS-6-6萃取物對DPPH·的清除率

高活性菌株LTS-6-6不同濃度萃取物對DPPH·清除率見表3和圖5。

表3 不同部位萃取物對DPPH·清除率

續表3(Continued Tab.3)

濃度Concentration(mg/mL)供試樣品清除率Scavenging effects of different samples(%)VCPEEEAEBAEWTE0.04096.74±0.0065.20±2.7494.94±0.3553.12±0.0919.79±0.420.05096.89±0.0474.78±0.4395.02±0.0264.36±2.6326.46±1.050.10097.10±0.0391.68±0.1497.79±2.4794.79±0.0050.45±0.00

圖5 高活性菌株不同萃取物對DPPH·的清除作用Fig.5 Scavenging effects of different extracts from LTS-6-6 on DPPH· radical

由表3和圖5可看出，高活性菌株發酵產物不同萃取物對DPPH·均表現出一定的清除能力，清除率都隨著濃度增大而升高，增大幅度均呈現出先逐漸增大后趨于穩定的現象。在0～0.1 mg/mL的濃度范圍內，EAE活性顯著高于其他萃取物；在0.02 mg/mL時，EAE對DPPH·的清除率即達到88.97%，其EC50為7 μg/mL，僅次于VC(EC50為4 μg/mL)。在0.1 mg/mL時，PEE和BAE對DPPH·的清除率分別為91.81%和94.79%，EC50分別為26 μg/mL和33 μg/mL。WTE對DPPH·的清除能力最弱，在0.1 mg/mL時清除率僅為50.44%，EC50為109 μg/mL。由此看出，不同萃取物中，對DPPH·清除能力由高到低依次為EAE>PEE>BAE>WTE，說明抗氧化活性物質主要集中在乙酸乙酯萃取相。這與圖4所示乙酸乙酯萃取相中總酚和總黃酮含量最高的結果相一致。這為高活性菌株LTS-6-6中的抗氧化活性物質的后續分離純化提供了重要參考依據。

3 結果與討論

本研究采用總還原力測定(FRAP法)和DPPH·自由基清除率評價了29株核桃內生真菌的抗氧化能力，供試菌株均表現出一定的抗氧化能力，其中以核桃青果皮中分離得到的菌株LTS-6-6抗氧化能力最強。

抗氧化劑可以抑制自由基的反應過程或干擾自由基連鎖反應的引發與擴散過程，本研究以總還原力測定(FRAP法)和DPPH·自由基清除率兩種方法，對核桃內生真菌的發酵產物的抗氧化活性進行探索，由于兩者的抗氧化作用機制不同，研究結果也稍有差異。本研究結果顯示，BAE的總還原力高于PEE，但在DPPH·清除試驗中，BAE的清除能力較弱，EC50略高于PEE。

部分內生真菌能夠參與植物活性成分的合成，產生與宿主植物相同的化合物及其衍生物[15]。Wei等[16]通過DPPH·及ABTS+·法評價了核桃青皮的抗氧化能力，結果發現，核桃青皮80%乙醇提物抗氧化能力與VC相當，并且總酚含量和抗氧化能力呈正相關關系。在本試驗中，高活性菌株LTS-6-6從核桃青果皮中分離得到，其發酵產物也表現出較好的抗氧化活性，這可能與宿主共生理論有關。另外，Pan等[17]報道的川貝母內生真菌中的抗氧化活性成分為多酚類、黃酮類物質。Huang等[18]研究了29株傳統中草藥分離到的內生真菌的抗氧化活性，并發現其抗氧化能力和發酵液中的多酚含量相關性較好。本研究結果與其一致。

核桃是我國重要的經濟作物,種植范圍廣泛，內生真菌資源豐富。Liu等[19]采用組織分離法對藍田不同季節核桃樹的不同組織部位內生真菌進行分離，共分離獲得隸屬于47個屬的核桃內生真菌676株；Yimaer等[20]研究了陜西山陽縣、藍田縣與宜君縣不同生境春季核桃內生真菌的多樣性，從576塊組織塊中共分離得到392株內生真菌。本研究僅從實驗室保存的大量菌株中選擇了29株進行抗氧化活性的探索，可供篩選菌株還很多，有望從中發現更有潛在價值的高活性菌株。