正交試驗優選脫糖大棗的制備工藝

馬寶珠，劉世軍，唐志書，李慧，張娛，宋忠興，崔春利，許洪波，劉紅波，張軍武，王少程

(陜西中醫藥大學/陜西省中藥資源產業化協同創新中心/秦藥特色資源研究開發國家重點實驗室(培育)/陜西省創新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083)

大棗為鼠李科植物棗(Ziziphus jujuba Mill.)的干燥成熟果實[1]，在中國已有三千多年的歷史。中國各地均有栽培，世界上90%以上的大棗都產自中國[2]。雖然我國有著豐富的大棗資源，但大棗的深加工系列產品缺乏，使大棗產量和果農的經濟收入不成比例。

隨著社會的發展，我國糖尿病人急劇增長，加上人們對自我身材完美的追求，“戒糖”這個概念逐漸滲透到人們的日常飲食中，而大棗含糖量高達50 %～80 %[2]，讓人望而生畏。“糖”已經讓人變得恐懼起來。

實驗采用L9(34)正交試驗法來優化大棗醇提工藝，在降低大棗中單糖的同時，最大化的保留大棗中的其它活性成分，讓人們能夠食用到含糖量低而又更健康的脫糖大棗，也為大棗的進一步深加工提供實驗依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

電熱鼓風干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(天津鑫博得儀器有限公司)；KQ-300DE型數控超生波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-2600紫外可見分光光度計(日本島津)；電子分析天平(賽多利斯科儀器有限公司)。

1.2 試劑

葡萄糖(分析純，天津市大茂化學試劑)；氫氧化鈉(分析純，天津市天力化學試劑有限公司)；3，5-二硝基水楊酸(化學純，上海科豐實業有限公司)；硫酸(分析純，成都市科隆化學品有限公司)；亞硫酸鈉(分析純，天津市天力化學試劑有限公司)；苯酚(分析純，天津市天力化學試劑有限公司)；酒石酸鉀鈉(分析純，天津市天力化學試劑有限公司); 無水乙醇(分析純，安徽安特食品股份有限公司)。

1.3 材料

實驗所用大棗為購于咸陽市人人樂超市，為新疆和田大棗。

2 方法和結果

2.1 總糖含量測定方法

2.1.1 總糖標準曲線的繪制 分別精密移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的0.1 mg·mL-1葡萄糖溶液于具塞試管中，各加純化水至2 mL，精密加入6 %苯酚溶液(由80%苯酚現配)1.0 mL，搖勻后立刻加入濃硫酸5.0 mL，常溫放置30 min后冰水浴5 min，于490 nm處用紫外可見分光光度計測其吸光度值[3]。空白對照則以2 mL純化水代替葡萄糖溶液。標準曲線圖則以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標進行繪制，見圖1。回歸方程：y = 17.211x - 0.0494; 相關系數：R2= 0.9990。

2.1.2 樣品中總糖的測定方法 將樣品加純化水稀釋至合適的倍數，于超聲波清洗器中超聲40 min，即得樣品溶液。測定前，將樣品溶液搖勻，精密移取2 mL于具塞試管中，加入 6% 的苯酚溶液1 mL，搖勻后立即加入濃硫酸5 mL。常溫放置30 min后冰水浴5 min，于490 nm處用紫外可見分光光度計測其吸光度值。空白對照則以2 mL純化水代替葡萄糖溶液。最后根據“2.1.1”所得的總糖標準曲線線性回歸方程求得樣品溶液中總糖濃度。

2.2 還原糖含量的測定方法

2.2.1 DNS試劑的配置[4]主要有:

A液：稱取6.3 g DNS，21.0 g氫氧化鈉充分溶解于400 mL超聲脫氣后的純化水中。

B液：稱取182.0 g酒石酸鉀鈉溶解于400 mL脫氣后的溫水中，再加入5.0 g的苯酚，5.0 g的亞硫酸鈉，攪拌使其溶解，并放置至常溫。

最后將A液與B液混合均勻，倒入1 000 mL的棕色容量瓶中并定容至刻度線，即為配制好的DNS試劑。將DNS試劑冷藏于冰箱中備用。

2.2.2 還原糖標準曲線的制備[5～7]精密移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL的1.00 mg·mL-1葡萄糖溶液于25 mL容量瓶中，各加純化水至2 mL，再精密移取5.0 mL DNS試劑加入容量瓶中。快速搖勻，沸水浴5 min后，立即冷卻20 min置于冰水中，最后定容至刻度線，于493 nm處用紫外可見分光光度計測其吸光度。空白對照則以2 mL純化水代替葡萄糖溶液。標準曲線圖則以橫坐標為濃度，縱坐標為吸光度進行繪制，見圖2。回歸方程：y = 31.442x - 0.0759；相關系數：R2= 0.9992。

2.2.3 條件優化 主要有:

(1)顯色條件。通過閱讀文獻發現，苯酚-硫酸法測總糖的方法大都一致，而DNS法測還原糖時，由于DNS試劑的配置比例不同等原因，顯色條件也有較大的不同。因此，針對還原糖的測定進行顯色條件優化。

(2)最大吸收波長的選擇。按照“2.2.2”的測定方法進行，精密移取1.00 mg·mL-1的葡萄糖溶液1 mL于25 mL容量瓶中，加水1 mL，再加5.00 mL DNS試劑，沸水浴3 min，冰水浴20 min，定容至刻度線，于450～1 600 nm波長范圍內用紫外可見分光光度計進行光譜掃描。掃描結果見圖3。由圖可知，波長為493 nm時有最大吸光度，故筆者實驗還原糖測定時選用的波長為493 nm。

(3)顯色劑用量的選擇。在6只25 mL容量瓶中，按照“2.2.2”的測定方法進行，加入1 mg·mL-1的葡萄糖溶液1 mL，DNS溶液加入量依次為2、3、4、5、6、7 mL，沸水浴3 min。結果見圖4。由圖可知，DNS用量為 4～17 mL時，吸光度趨于穩定，DNS用量為5 mL時，吸光度最大，故選擇加入顯色劑的用量為 5 mL。

(4)顯色反應時間的選擇。

在5只25 mL容量瓶中，按照“2.2.2”的測定方法進行，加入1 mg·mL-1的葡萄糖溶液1 mL，DNS溶液5 mL，分別沸水浴3、4、5、6、7 min。結果見圖5。由圖5可知，顯色反應時間為5 min時測定的吸光度最大，故選擇顯色反應時間為5 min。

2.2.4 方法學考察 主要有:

(1)精密度實驗。分別精密移取0.5 mL的1 mg·mL-1葡萄糖溶液于6只25 mL容量瓶，按照還原糖標準曲線測定方法測定吸光度值，測得吸光度分別為0.565、0.573、0.563、0.566、0.572、0.580，RSD=1.11%。結果表明，吸光度無明顯變化，說明方法精密度良好。

(2)穩定性實驗。分別精密移取0.5 mL的1mg·mL-1葡萄糖溶液于6只25 mL容量瓶，按照還原糖標準曲線測定方法每隔5 min測一次吸光度，連續30 min考察穩定性。測得吸光度分別為0.559、0.573、0.547、0.555、0.564、0.568，RSD=1.67%。結果表明，吸光度值30 min內無明顯變化，說明方法穩定性良好。

(3)還原糖加樣回收實驗。精密移取已知還原糖(大棗粉末還原糖)含量為0.34421 mg·mL-1的樣品溶液0.5 mL，按還原糖含量的80 %、100 %、120 %，加入對應葡萄糖濃度的溶液0.5 mL，按照“2.2.2”還原糖標準曲線測定方法的實驗方法測定吸光度值，計算回收率，結果見表1。

表1 還原糖加樣回收實驗

結果顯示，還原糖平均加樣回收率為101.17%，RSD為4.27 %。符合要求。

2.2.5 樣品中還原糖的測定方法 將樣品加純化水稀釋至合適的倍數，于超聲波清洗器中超聲40 min，即得樣品溶液。取1 mL樣品溶液并加純化水至2 mL于25 mL容量瓶中。加入5 mL的DNS溶液，搖勻后沸水浴5 min顯色，然后冰水浴20 min，再加純化水定容至刻度線，搖勻，于493 nm處用紫外可見分光光度計測其吸光度。以2 mL純化水代替樣品溶液作空白對照。最后根據“2.2.2”還原糖標準曲線線性回歸方程求得樣品溶液中還原糖濃度。

2.3 脫糖原理及工藝

大棗中含有單糖(葡萄糖、果糖)、低聚糖和多糖，根據果糖易溶于乙醇，葡萄糖微溶于乙醇，而多糖難溶于醇，故可以利用單糖和多糖在乙醇溶液中的溶解度不同進行簡單分離，去除掉單糖部分。

用乙醇溶液對大棗粉末加熱回流提取，選取對醇提工藝影響較大的四個因素，乙醇濃度，提取時間，加醇量，提取次數進行單因素考察，最后利用正交試驗優選出最佳的提取工藝。

2.4 醇提工藝的優選

2.4.1 大棗吸水率的考察 將大棗清洗、去核、烘干、粉碎并過4號篩，制的大棗粉末備用。

稱取50 g大棗粉末3份于燒杯中，加200 mL水，搖勻后浸泡至大棗粉末完全濕潤，濾過，測量吸水率[8]。結果見表2。

表2 大棗粉末吸水率測定結果

由表2可知，大棗粉末的吸水率為106.24%，約為大棗粉末量的1倍，故在第1次加液體時多加1倍量液體。

2.4.2 醇提工藝的評價指標[9-10]實驗對大棗進行醇提主要為了在保留大棗中多糖及低聚糖的同時，脫除掉還原糖。故以多糖及低聚糖含量和還原糖脫除率作為考察醇提效果的兩個主要指標，權重系數各為0.4。另外，將棗渣的產率作為次要指標，權重指數占0.2。采用綜合加權評分法，對醇提試驗進行優選。

多糖及低聚糖含量=(總糖含量-還原糖含量)×100%

還原糖脫除率=

2.4.3 單因素實驗 通過閱讀大量參考文獻得知，對醇提工藝影響較大的四個因素為乙醇濃度，提取時間，加醇量，提取次數[11～12]。對這四個因素分別進行單因素考察，根據綜合評分結果，每個因素優選出三個最佳水平。

(1)乙醇濃度的考察。準確稱取5份50 g的大棗粉末，根據吸水率為106.24%，故選擇加入10倍量的乙醇，乙醇濃度分別為100%、90%、80%、70%、60%，加熱回流60 min。濾過，將棗渣晾干，稱重。取適量棗渣，加水稀釋至合適濃度，測其總糖和還原糖含量。結果見表3。

表3 乙醇濃度對醇提結果的影響

由表3可知，提取時乙醇濃度的不同，醇提效果也有較大的變化。隨著醇提濃度的變小，綜合評分也變小。當提取時乙醇濃度為60%，不便于抽濾，故沒考察其醇提效果。綜合考慮，正交試驗醇提濃度選擇80%、90%、100%這3水平。

(2)提取時間的考察。準確稱取5份50 g的大棗粉末，各加入10倍量的無水乙醇，分別加熱回流提取20 min、40 min、60 min、80 min、100 min，濾過，將棗渣晾干，稱重。取適量棗渣，加水稀釋至合適濃度，測其總糖和還原糖含量。結果見表4。

表4 提取時間對醇提結果的影響

由表4可知，提取時醇提時間的變化，對醇提效果有一定的影響。醇提時間為20 min時，醇提效果稍差，醇提時間為40 min、60 min、80 min、100 min時，綜合評分相差不大。綜合考慮，正交試驗醇提時間選擇40 min、60 min、80 min這3水平。

(3)加醇量的考察。準確稱取5份50 g的大棗粉末，分別加入8、10、12、14、16、18倍量的無水乙醇，加熱回流提取60 min，濾過，將棗渣晾干，稱重。取適量棗渣，加水稀釋至合適濃度，測其總糖和還原糖含量。結果見表5。

表5 加醇量對醇提結果的影響

由表5可知，提取時加醇量的不同，醇提效果也有較大的變化。隨著加醇量的變大，綜合評分也顯著增大。綜合考慮，正交試驗加醇量選擇12倍、14倍、16倍這3水平。

(4)提取次數的考察。根據實際應用及習慣，正交試驗醇提次數直接選取1次、2次、3次。

2.4.4 正交實驗 根據“2.4.3”的單因素考察結果，設計L9(34)正交試驗表[13]。見表6。稱取50 g大棗粉末，按正交試驗表進行醇提。見表7、表8。

表6 醇提因素水平設計

表7 醇提工藝正交試驗結果

表8 醇提工藝方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.00

根據對醇提工藝正交試驗結果分析發現，4個因素對大棗醇提效果的影響程度為提取濃度(D)>加醇量(B)>提取次數(C)>提取時間(A)。每個因素下，3個水平的影響程度為A3>A1>A2，B3>B1>B2，C3>C1>C2，D3>D1>D2。根據對方差分析發現，乙醇濃度具有極顯著性差異，加醇量具有顯著性差異。從節約資源、試劑等多方面綜合考慮，大棗最佳的醇提工藝為A1B3C1D3，用16倍量的無水乙醇提取1次，每次40 min。

2.4.5 驗證實驗 準確稱取大棗粉末50 g，加16倍量無水乙醇，又根據吸水率為106.24 %，故加850 mL無水乙醇，加熱回流提取40 min。將回流液抽濾，取濾餅即棗渣烘干，稱重，并取棗渣測其總糖和還原糖。重復三次，結果見表9。

表9 醇提工藝驗證試驗結果

結果表明，在此最佳工藝條件下，所得到的大棗渣中多糖及低聚糖的含量由原大棗粉末的41.08%升至59.14%，還原糖的脫除率高達70.22%，棗渣的率為68.00%，說明此醇提工藝條件穩定，可靠。

3 討論

大棗含有單糖，低聚糖和多糖。單糖即還原糖，含量測定采用3，5-二硝基水揚酸法；總糖含量測定采用苯酚-硫酸法；大棗中多糖和低聚糖的含量測定目前都是通過總糖與還原糖含量之差來反映。不同地區，不同品類中棗的還原糖差異較大，牛林茹，李濤等人通過對7種大品類紅棗還原糖含量測定后發現還原糖含量占總糖還量的44.9%～74.4%[14]。大棗中的單糖(主要為葡萄糖和果糖[15])對人體不太友善。葡萄糖被人體小腸吸收后容易引起血糖升高，不宜短時間內大量食用；果糖可以轉化成為脂肪，是導致人體的肥胖的重要因素。大棗中低聚糖又分為普通低聚糖和功能性低聚糖，功能性低聚糖具有低熱量、調節腸胃菌群結構、有利于鈣的吸收、降低膽固醇、防止腹瀉和便秘等生理作用[16]。但是目前對大棗低聚糖的研究不夠深入，具體含量也不得而知，但安曉南發現大棗低聚糖中兩種較高的糖為蔗果三糖和蔗果四糖，均不具有還原性[17]。大棗多糖的保肝、抗氧化、抗疲勞、調節機體免疫力等多種作用目前也是毋庸置疑的[18～20]。

采用正交試驗優化大棗的醇提工藝，將大棗中的還原糖盡可能多的脫除，最大化地保留大棗中的低聚糖、多糖及其它成分，從而得到適合不同人群的“脫糖大棗”，豐富大棗系列健康產品。