外周血ALDH7A1 mRNA表達水平對乙肝后肝硬化患者Child分級和預后的評估價值

詹有芳，張 玨△，王 鵬

1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院檢驗科，上海 200021；2.上海市浦東新區婦幼保健院檢驗科，上海 201206

肝硬化是我國常見疾病之一，它是由不同病因引起的慢性進行性彌漫性肝病，病理上以肝臟彌漫性纖維化、再生結節和假小葉形成為特征[1-2]。肝硬化患者起病較為隱匿，病程持續較長，發展緩慢[3]，是導致肝移植、肝癌及肝病相關死亡的重要危險因素[4]。由于肝硬化病變較難控制，使患者生存質量和生存時間都受到嚴重影響。因此，準確評估肝硬化患者的嚴重程度對監測疾病進展和判斷疾病預后有重要參考價值[5]。本研究檢測了外周血乙醛脫氫酶(ALDH7A1)家族成員ALDH7A1 mRNA在不同Child分級乙肝后肝硬化患者中的表達水平，分析其與臨床生化指標的相關性，進一步考察ALDH7A1對Child分級的診斷識別能力，以及與不同并發癥的關系，旨在評估ALDH7A1在乙肝后肝硬化患者疾病進展和預后中的臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取乙肝后肝硬化患者90例，其中Child A、B和C級各30例作為乙肝后肝硬化組，參照《病毒性肝炎防治方案》[6]中有關乙肝后肝硬化的診斷標準確診并分級，其中男60例，女30例，年齡37～62歲，平均(50.05±1.21)歲。乙肝后肝硬化為慢性乙肝發展的結果，肝組織病理學表現為彌漫性肝纖維化及結節形成，二者必須同時具備才能診斷。(1)代償性肝硬化指早期肝硬化，一般屬Child A級，可有輕度乏力、食欲減弱或腹脹癥狀，尚無明顯肝功能衰竭表現。血清清蛋白(ALB)水平降低，但仍≥35 g/L，血清總膽紅素(TBIL)≤35 μmol/L，凝血酶原活動度>60%。血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)及天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)水平輕度升高，AST水平可高于ALT，γ-谷氨酰轉移酶水平可輕度升高。可有門靜脈高壓，如輕度食管靜脈曲張，但無腹水、肝性腦病或上消化道出血。(2)失代償性肝硬化指中、晚期肝硬化，一般屬Child B、C級，有明顯肝功能異常及失代償征象，如血清ALB<35 g/L，明顯黃疸，血清TBIL>35 μmol/L，ALT和AST水平升高，凝血酶原活動度<60%。患者可出現腹水、肝性腦病及門靜脈高壓引起的食管、胃底靜脈明顯曲張或破裂出血。Child評分標準見表1,將所記分數相加，根據總分分為A、B、C級。A級≤6分；B級>6～9分；C級>9分。另選取健康志愿者30例作為健康對照組，其中男20例，女10例，年齡35～60歲，平均(47.63±12.37)歲。兩組研究對象性別和年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

表1 Child肝功能分級評分標準

1.2排除標準 合并嚴重心、膽、腎、內分泌、造血系統及精神神經疾病者；妊娠或哺乳期婦女。

1.3方法 標本及信息收集：采集各研究對象清晨空腹乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝靜脈血5 mL，用淋巴細胞分離液獲取外周血單個核細胞，采用TRIzol試劑(Thermo，美國，型號：15596026)提取細胞總RNA，-80 ℃保存待測。另抽取各研究對象靜脈血5 mL，分離血清，檢測ALT、AST、ALB、TBIL、透明質酸(HA)等臨床指標水平。同時記錄肝硬化患者食管胃底靜脈曲張、消化道出血、自發性腹膜炎、脾大等并發癥信息。實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測：將總RNA反轉錄為cDNA，采用qRT-PCR進行擴增，以GAPDH作為內參。ALDH7A1上游引物序列：5′-CAT GGC GTG AGT GAA GGA C-3′，下游引物序列：5′-CAG GGC AAT AGG TCG TAA TAA CC-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGG TAT CGT GGA AGG ACT CAT GAC-3′，下游引物序列：5′-ATG CCA GTG AGC TTC CCG TTC AGC-3′。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min，然后進行40個循環(94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，最后72 ℃延伸5 min。采用2-ΔΔCt表示ALDH7A1 mRNA的相對表達量。

2 結 果

2.1健康對照組和乙肝后肝硬化組不同Child分級患者ALDH7A1 mRNA表達水平比較 見表2。與健康對照組比較，乙肝后肝硬化組不同Child分級的患者ALDH7A1 mRNA表達水平均明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)；與Child A級組比較，Child B級組和Child C級組ALDH7A1 mRNA表達水平均明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)；與Child B級組比較，Child C級組ALDH7A1 mRNA表達水平雖有所下降，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 健康對照組和乙肝后肝硬化組不同Child分級的患者ALDH7A1 mRNA表達水平比較

注：與健康對照組比較，*P<0.05；與Child A級組比較，#P<0.05。

2.2乙肝后肝硬化患者ALDH7A1 mRNA與臨床生化指標的相關性分析 乙肝后肝硬化患者ALT水平為(102.51±62.07)U/L，AST水平為(138.70±72.35)U/L，ALB水平為(32.31±15.46)g/L，TBIL水平為(58.18±34.72)μmol/L，HA水平為(218.16±133.98)ng/mL，Child得分為(8.57±4.32)分。ALDH7A1 mRNA表達水平與肝損傷指標ALT、AST呈負相關(r=-0.57、-0.59，P<0.05)，與肝臟生物合成能力指標ALB呈正相關(r=0.37，P<0.05)，與肝臟解毒能力指標TBIL呈負相關(r=-0.72，P<0.05)，與纖維化指標HA呈負相關(r=-0.64，P<0.05)，與Child得分呈負相關(r=-0.539，P<0.05)。

2.3ALDH7A1 mRNA在不同Child分級的乙肝后肝硬化患者中ROC曲線分析 為衡量ALDH7A1 mRNA對不同Child分級的乙肝后肝硬化患者的診斷識別能力，對相鄰Child分級之間進行ROC曲線分析見圖1，即Child A級組和Child B級組及Child B級組和Child C級組之間比較。ALDH7A1 mRNA對Child A級和Child B級的識別能力較強，ROC曲線下面積(AUC)為0.859，而對Child B級和Child C級的識別能力較弱，AUC僅為0.681。

注：A為Child A級和Child B級比較；B為Child B級和Child C級比較。

圖1乙肝后肝硬化患者不同Child分級間ROC曲線分析

2.4乙肝后肝硬化患者有無并發癥時ALDH7A1 mRNA表達水平比較 見圖2。90例乙肝后肝硬化患者中出現食管胃底靜脈曲張58例，消化道出血48例，自發性腹膜炎29例，脾大33例，與無并發癥肝硬化患者比較，有并發癥患者ALDH7A1 mRNA表達水平均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖2 乙肝后肝硬化患者有無并發癥時ALDH7A1 mRNA表達水平比較

3 討 論

肝硬化是一種嚴重的肝臟疾病，該類患者的疾病進展監控和預后判斷一直是臨床研究的重要課題。早期肝硬化患者癥狀不甚明顯，發展至后期則會出現肝功能衰竭、肝酶水平逐漸升高、門靜脈高壓等癥狀，甚至出現出血傾向[7]。另一方面，肝硬化患者5年生存率高達85%以上，但發生腹水、肝腎綜合征、肝性腦病等不良事件后會導致患者病情快速惡化，大幅度降低患者5年生存率[8]。因此，對肝硬化患者進行早期診斷和改善預后是目前急需解決的問題。

ALDH7A1是乙醛脫氫酶家族成員之一[9]，乙醛脫氫酶家族與生物氧化關系密切，是線粒體內重要的醛類氧化酶，能夠氧化多種有害的芳香醛和脂肪醛，防止其對細胞膜的脂質過氧化，是機體重要的保護因子之一[10]。脂質過氧化反應在Kuffer細胞和Ito細胞的激活及其膠原基因的表達，以及肝纖維化、肝硬化的形成過程中起重要作用，脂質過氧化反應可能是連接組織損傷、肝纖維化及肝硬化的紐帶[11]。有研究顯示，ALDH7A1能夠緩解乙醛等醛類和氧化應激導致的細胞毒性[12]。還有學者發現，ALDH7A1在藥物誘導的肝脂質變性中呈時間/劑量依賴性增加[13]。

本研究采用qRT-PCR檢測不同Child分級的乙肝后肝硬化患者外周血ALDH7A1 mRNA表達水平發現，隨著Child分級增加，ALDH7A1 mRNA表達水平逐漸下降，且ALDH7A1表達水平與肝損傷程度、肝生物合成能力、肝解毒能力、肝纖維化程度等多項臨床指標具有相關性。進一步分析發現，ALDH7A1 mRNA表達水平對乙肝后肝硬化早期的Child A級和Child B級識別能力較強，具有一定的早期診斷價值。同時，ALDH7A1 mRNA低表達患者預后較差，可能出現食管胃底靜脈曲張、消化道出血、自發性腹膜炎、脾大等多種并發癥，說明ALDH7A1對乙肝后肝硬化的預后也具有一定指導意義。

綜上所述，ALDH7A1可能是乙肝后肝硬化疾病進展監控和預后判斷的一項潛在生物標志物，在臨床上具有重要參考價值。